Пробирного повреждений ДНК в нейронах гиппокампа с помощью комет
Summary
Комет является эффективным способом выявления одно-и двунитевых разрывов, в том числе щелочно-лабильных сайтов и DNA-DNA/DNA-protein поперечных связей в ДНК во всех клетках, включая нейроны гиппокампа. Метод использует дифференциальные миграции ДНК в электрическом поле из-за различий в количестве повреждения ДНК.
Abstract
Ряд препаратов нацелены на пути репарации ДНК и вызывают гибели клеток путем создания повреждения ДНК. Таким образом, процессы непосредственно измерить повреждения ДНК были тщательно оценены. Традиционные методы занимают много времени, дорого, ресурсоемкие и требуют репликации клеток. В отличие от комет, одна ячейка гель-электрофореза анализа, более быстрый, неинвазивный, недорогой, прямые и чувствительным показателем повреждения и репарации ДНК. Все формы повреждения ДНК, а также репарации ДНК могут быть визуализированы на одном уровне ячейки с помощью этой мощной техникой.
Принцип, лежащий в основе комет является то, что нетронутыми ДНК высоко упорядоченной, тогда как повреждение ДНК, нарушает эту организацию. Поврежденной ДНК проникает в агарозном матрицы и при воздействии электрического поля, отрицательно заряженная ДНК мигрирует к катоду, который заряжен положительно. Большая неповрежденной нити ДНК не способны мигрировать далеко от ядра. Повреждение ДНКсоздает меньшие фрагменты ДНК, которые едут дальше, чем нетронутыми ДНК. Комет, программное обеспечение для анализа изображений, меры и сравнивает общую интенсивность флуоресценции ДНК в ядро с ДНК, которые мигрировали из ядра. Флуоресцентный сигнал от перенесенных ДНК пропорционально повреждения ДНК. Более яркий хвост ДНК означает, увеличилось повреждение ДНК. Некоторые из параметров, которые измеряются хвост момент, который является мерой как количество ДНК и распределение ДНК в хвост, длина хвоста и процент ДНК в хвосте. Этот тест позволяет измерять репарации ДНК, а так как разрешение повреждения ДНК означает ремонта произошло. Предел чувствительности составляет около 50 разрывы нитей в диплоидных млекопитающих 1,2 клетки. Клетки, обработанные с любой ДНК-повреждающих агентов, таких как этопозид, могут быть использованы в качестве положительного контроля. Таким образом, метод ДНК-комет является быстрой и эффективной процедурой для оценки повреждения ДНК.
Protocol
Discussion
Комет имеет уникальную способность анализировать отдельные клетки. Это выгодно в идентификации субпопуляций клеток, которые демонстрируют дифференциального ответ на цитотоксических агентов. Несколько практических ограничений должны быть приняты во внимание. Количество ячеек, кото…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана IMPACT премию от департамента радиационной онкологии Университета Алабамы в Бирмингеме Всесторонний Онкологический центр, Фонд рака Борьба с детской, и Габриель Ангел Foundation (до ESY.).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O’Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. . Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
