Hele Mount RNA TL<em> In situ</em> Hybridisatie van<em> Drosophila</em> Embryo's
Summary
Hier beschrijven we een geheel gemonteerde fluorescent<em> In situ</em> Hybridisatie (FISH)-protocol voor het bepalen van de expressie en lokalisatie eigenschappen van RNA's die tijdens de embryogenese in de fruitvlieg,<em> Drosophila melanogaster</em>.
Abstract
Beoordelen het expressiepatroon van een gen, alsmede de subcellulaire lokalisatie eigenschappen van het getranscribeerde RNA, zijn kenmerkend voor het begrijpen van de biologische functie tijdens de ontwikkeling. RNA in situ hybridisatie (ISH-RNA) is een krachtige methode voor het visualiseren RNA distributie eigenschappen, ten organismale cellulaire of subcellulaire niveau 1. RNA-ISH is gebaseerd op de hybridisatie van een gemerkte probe nucleïnezuur (bijvoorbeeld antisense RNA, oligonucleotiden) complementair aan de sequentie van een mRNA of een niet-coderende RNA doelwit van belang 2. De procedure vereist primaire sequentie informatie alleen te genereren sequentie-specifieke probes, kan algemeen worden toegepast op een groot aantal organismen en weefselmonsters 3. Uit een aantal grootschalige ISH studies zijn uitgevoerd om genexpressie documenteren en lokalisatie dynamiek RNA in verschillende modelorganismen, heeft dat tot devestiging van belangrijke communautaire middelen 4-11. Hoewel verschillende probe labeling en detectie strategieën zijn ontwikkeld de afgelopen jaren de gecombineerde gebruik van fluorescentie-gemerkt detectiereagentia en enzymatische signaalversterking stappen bieden significante verbeteringen in de gevoeligheid en resolutie van de procedure 12. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd fluorescente in situ hybridisatie methode (FISH) gebruik tyramide signaalamplificatie (TSA) om RNA expressie en lokalisatie dynamiek opgevoerd Drosophila embryo zichtbaar. De procedure wordt uitgevoerd in 96-well plaat formaat PCR, die aanzienlijk vergemakkelijkt het gelijktijdig verwerken van grote aantallen monsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor sonde synthese stappen, hebben we meestal het genereren van run-off antisense RNA probes door in vitro transcriptie van volledige lengte Drosophila cDNA geamplificeerd van plasmiden in de Drosophila Gen (DGC), een bron beschreven op de volgende website: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Deze benadering is veelvuldig gebruikt in grootschalige ISH studies gericht op het in kaart brengen van gene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werkzaamheden die in het Lecuyer laboratorium wordt ondersteund door financiering van de National Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) en het Fonds de Recherche en Sante du Quebec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre en Gaël Moquin-Beaudry worden ondersteund door NSERC undergraduate research studiebeurzen, terwijl Carole Iampietro wordt ondersteund door de Angelo Pizzagalli postdoctoraal fellowship.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
References
- Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
- Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
- Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
- Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
- Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
- Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O’Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
- Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
- Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
- Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).
