Tüm Dağı RNA Floresan<em> In situ</emVe> Hibridizasyon<em> Drosophila</em> Embriyolar
Summary
Burada bir bütün montaj floresan tarif<em> In situ</emMeyve sinekleri embriyogenez sırasında ifade RNA'ların ekspresyonu ve lokalizasyonu özelliklerini belirlemek için> hibridizasyon (FISH) protokolü,<em> Drosophila melanogaster</em>.
Abstract
Bir gen, hem de kendi RNA transkripsiyonu hücre içi lokalizasyonu özellikleri, salgılama modelini değerlendirilmesi gelişme sırasında biyolojik işlevlerini anlamada için önemli özellikleri vardır. In situ hibridizasyon RNA (RNA-ISH) RNA dağılımı özelliklerine görselleştirmek için kullanılan güçlü bir yöntemdir, organizmalar, hücresel ya da hücre içi düzeylerinin 1 olması. RNA-ISH bir mRNA veya ilgi içinde bir 2 kodlayıcı olmayan RNA hedef sekansına tamamlayıcı bir etiketli nükleik asit sondası (örneğin, antisens RNA, oligonükleotidler) ve hibridizasyon dayanmaktadır. Işlem dizi spesifik prob oluşturmak için tek başına birincil sıralama bilgisinin gerektirdiği gibi, evrensel organizmalar ve doku örnekler, 3, geniş bir alanda uygulanabilir. Gerçekten de, büyük ölçekli ISH çalışmalar bir dizi gen ekspresyon belgelemek ve çeşitli model organizmaların yerelleştirme dinamikleri RNA uygulanan edilmiştir hangi yol açtıönemli topluluk kaynaklarını 4-11 kurulması. Prob etiketleme ve algılama çeşitli stratejiler yılda geliştirilmiş olmasına rağmen, floresan-etiketli algılama reaktifler ve enzimatik sinyal amplifikasyon adımlar kombine kullanımı prosedürü 12 hassasiyet ve çözünürlük önemli iyileştirmeler sunuyor. Burada sahnelenen Drosophila embriyolar RNA ekspresyonu ve lokalizasyonu dinamikleri görselleştirmek için tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) kullanılarak in situ hibridizasyon metodu (FISH), optimize edilmiş floresan tarif. Işlem çok sayıda numune eş zamanlı olarak işlem kolaylaştırır 96-kuyulu plaka PCR formatında gerçekleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prob sentez adımlar için, biz genellikle Drosophila Gen Koleksiyonu (DGC), aşağıdaki web sitesinden ayrıntılı bir kaynak bulunan plazmidler amplifiye tam uzunlukta Drosophila DNA'larının in vitro transkripsiyon tarafından işletilen-off antisens RNA problar oluşturmak: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Bu yaklaşım sinek embriyolar 9,16 haritalama gen ekspresyonu ve mRNA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lecuyer laboratuarda yürütülen çalışmalar Ulusal Bilimler ve Kanada'nın Mühendislik Konseyi (NSERC), Sağlık Araştırması (CIHR) ve Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ve Kanada Enstitüsü fon tarafından desteklenmektedir. Carole Iampietro Angelo PIZZAGALLI doktora sonrası dostluk tarafından destekleniyor ise Fabio Alexis Lefebvre ve Gaël Moquin-Beaudry'den, NSERC lisans araştırma studentships tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
References
- Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
- Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
- Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
- Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
- Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
- Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O’Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
- Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
- Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
- Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).
