مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية
Summary
نحن تصف طريقة قوية لونين مناعي باستخدام خلايا T الأولية. تأسست هذه الطريقة على النهج القياسية، ولكن يستخدم مجموعة محددة من الظروف والكواشف التي تعمل على تحسين كفاءة لكميات محدودة من الخلايا. الأهم من ذلك، يتم تقديم وصفا مفصلا لمرحلة تحليل البيانات.
Abstract
لونين مناعي (رقاقة) هو وسيلة على نطاق واسع المستخدمة لتحديد تفاعلات البروتينات المختلفة مع الحمض النووي في لونين من الخلايا الحية. ومن الأمثلة على ذلك تسلسل محدد الحمض النووي ملزم النسخ العوامل، histones ودولهم تعديل مختلفة، والإنزيمات مثل بلمرة RNA والعوامل المساعدة، ومكونات إصلاح الحمض النووي. على الرغم من الوجود المطلق لها، هناك نقص يصل إلى التاريخ، منهجيات تفصيلية لكلا إعداد مقاعد البدلاء من المواد وتحليل دقيق يسمح المقاييس الكمية للتفاعل. ونظرا لهذا النقص في المعلومات، وأيضا لأنه، مثل أي مناعي، وظروف يجب إعادة الأمثل لمجموعات جديدة من الظروف التجريبية، ومقايسة الشذرة هو عرضة للنتائج غير دقيقة أو الكمي على نحو رديء.
مشتق بروتوكول لدينا في نهاية المطاف من العمل المنوي على عامل النسخ: التفاعلات الحمض النووي 1،2، ولكن يشتمل على عدد من التحسينات لsensitivity واستنساخ للحصول يصعب أنواع الخلايا. وقد تم استخدام بروتوكول بنجاح 3،4، على حد سواء باستخدام QPCR لقياس تخصيب الحمض النووي، أو باستخدام متغير شبه الكمي للبروتوكول أدناه.
يتم عمل هذا التحليل الكمي للمواد PCR-تضخيم حسابيا، ويمثل عاملا مقيدا في مقايسة. وتشمل الضوابط المهمة وغيرها من الاعتبارات استخدام الأجسام المضادة نمط إسوي المطابقة، وكذلك تقييم لمنطقة سيطرة الحمض النووي الجيني، مثل المنطقة بين الجينات وتوقع ألا تكون ملزمة للبروتين قيد الدراسة (أو المتوقع لا لإظهار التغييرات تحت الظروف التجريبية). وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام منحنى القياسية للمواد المدخلات لكل عينة الشذرة لاستخلاص المستويات المطلقة للتخصيب في المواد التجريبية. استخدام منحنيات معيار يساعد على مراعاة الاختلافات بين مجموعات التمهيدي، بغض النظر عن كيفية بعناية أنها مصممة، وأيضا كفاءة تختلفences في جميع أنحاء مجموعة من تركيزات قالب لمجموعة التمهيدي واحد. بروتوكول لدينا يختلف عن غيرها من الجهات التي تتوفر 5-8 في أننا تغطية على نطاق واسع في مرحلة لاحقة، وتحليل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وينص البروتوكول أعلاه وسيلة قوية من قياس بدقة تخصيب DNA من الخلايا الليمفاوية الأولية باستخدام رقاقة. وأحد الأسباب الرئيسية لمتانة في هذا البروتوكول هو إدراج البيولوجية مكررات. يستخدم بروتوكول أعلاه ثلاث مكررات، إثراء للوالذي يحسب بشكل مستقل. ثم يتم حساب متوسط ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح CA141009 وGM39067. نشكر E. بارنيل وR. Yarrington للتعليق على الجزء المكتوب.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | Store at RT |
| Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30256.01 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 04693116001 | Store at 4 °C |
| Protein G magnetic beads | Active Motif | 101945 | Store at 4 °C |
| RNase A (20 mg/ml) | EMD Millipore | 556746 | Store at -20 °C |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Roche | 03115879001 | Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0 |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-034 | Store at -20 °C |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | Store at -20 °C |
| 1 M Glycine | Store at RT | ||
| Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) | Store at 4 °C | ||
| Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) | Store at RT | ||
| ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) | Store at 4 °C | ||
| TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) | Store at 4 °C | ||
| Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) | Prepare fresh | ||
| 5 M NaCl | Store at RT | ||
| 0.5 M EDTA | Store at RT | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.5 | Store at RT | ||
| Table of Specific Reagents | |||
| Clay Adams Brand Nutator | Becton Dickinson | Model: 421105 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5342 | |
| Qiaquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Masonix Sonicator 3000 | QSonica | Model: S3000 | |
| UV Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
| Heating Block | VWR | 13259-030 | |
| Rotator | VWR | 80085-692 | |
| Refrigerated bench top centrifuge | Beckman Coulter | Model: Allegra X-12R | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Table of Equipment |
References
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 37-47 (2002).
- Li, Q., et al. Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity. J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).
- Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states. The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).
- Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. Genome-wide localization of replication factors. Methods. 57, 187-195 (2012).
- O’Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).
- Sikes, M. L., et al. A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation. Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4, 651-657 (2007).
