Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa
Summary
Se describe un método robusto para la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando células T primarias. El método se basa en los enfoques estándar, pero utiliza un conjunto específico de condiciones y reactivos que mejoran la eficiencia de unas cantidades limitadas de células. Es importante destacar que, se presenta una descripción detallada de la fase de análisis de datos.
Abstract
Cromatina immunoprecipitation (CHIP) es un método ampliamente utilizado para la determinación de las interacciones de las diferentes proteínas con el ADN en la cromatina de las células vivas. Los ejemplos incluyen la secuencia específica de unión al ADN, histonas factores de transcripción y sus diferentes estados de modificación, enzimas tales como polimerasas de ARN y factores auxiliares, y los componentes de reparación del ADN. A pesar de su ubicuidad, hay una falta de up-to-date, metodologías detalladas, tanto para la preparación del banco de material y para un análisis preciso permitir mediciones cuantitativas de interacción. Debido a esta falta de información, y también porque, como cualquier inmunoprecipitación, las condiciones deben ser re-optimizado para los nuevos conjuntos de condiciones experimentales, el chip de ensayo es susceptible a resultados imprecisos o mal cuantitativa.
Nuestro protocolo se deriva en última instancia del trabajo seminal en el factor de transcripción: interacciones ADN 1,2, pero incorpora una serie de mejoras a la sensividad y la reproducibilidad de difíciles a obtener tipos de células. El protocolo se ha utilizado con éxito 3,4, tanto utilizando qPCR para cuantificar enriquecimiento de ADN, o el uso de una variante semi-cuantitativa de la siguiente protocolo.
Este análisis cuantitativo de material amplificado por PCR se realiza computacionalmente, y representa un factor limitante en el ensayo. Controles y otras consideraciones importantes incluyen el uso de un anticuerpo de isotipo, así como la evaluación de una región de control del ADN genómico, tal como una región intergénica predicho no estar obligado por la proteína en estudio (o no anticipado para mostrar los cambios en virtud las condiciones experimentales). Además, una curva estándar de material de entrada para cada muestra de chip se utiliza para obtener los niveles máximos absolutos de enriquecimiento en el material experimental. El uso de las curvas de calibración ayuda a tener en cuenta las diferencias entre los conjuntos de cebadores, sin importar lo cuidadosamente que están diseñados, así como la eficiencia de diferentescias en todo el rango de concentraciones de la plantilla para un solo grupo de cebadores. Nuestro protocolo es diferente a otros que están disponibles en el 5-8 que cubrimos ampliamente la fase posterior análisis.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo anterior proporciona un método robusto de cuantificar con precisión enriquecimiento de ADN a partir de linfocitos primarios que utilizan chip. Una de las principales razones de robustez en este protocolo es la inclusión de repeticiones biológica. El protocolo anterior utiliza tres repeticiones, el enriquecimiento de la cual se calcula de forma independiente. Las salidas se promedian para proporcionar un grado de enriquecimiento y las desviaciones estándar calculadas para proporcionar una medida de la v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones CA141009 y GM39067. Agradecemos a E. Parnell y R. Yarrington los comentarios sobre la parte escrita.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | Store at RT |
| Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30256.01 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 04693116001 | Store at 4 °C |
| Protein G magnetic beads | Active Motif | 101945 | Store at 4 °C |
| RNase A (20 mg/ml) | EMD Millipore | 556746 | Store at -20 °C |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Roche | 03115879001 | Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0 |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-034 | Store at -20 °C |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | Store at -20 °C |
| 1 M Glycine | Store at RT | ||
| Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) | Store at 4 °C | ||
| Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) | Store at RT | ||
| ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) | Store at 4 °C | ||
| TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) | Store at 4 °C | ||
| Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) | Prepare fresh | ||
| 5 M NaCl | Store at RT | ||
| 0.5 M EDTA | Store at RT | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.5 | Store at RT | ||
| Table of Specific Reagents | |||
| Clay Adams Brand Nutator | Becton Dickinson | Model: 421105 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5342 | |
| Qiaquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Masonix Sonicator 3000 | QSonica | Model: S3000 | |
| UV Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
| Heating Block | VWR | 13259-030 | |
| Rotator | VWR | 80085-692 | |
| Refrigerated bench top centrifuge | Beckman Coulter | Model: Allegra X-12R | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Table of Equipment |
References
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