Gecombineerd Immunofluorescentie en DNA FISH op 3D-bewaarde interfase kernen aan veranderingen in 3D Nuclear Organisatie Studie
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).
Abstract
Fluorescente in situ hybridisatie met DNA probes on 3-dimensionaal bewaard kernen gevolgd door 3D confocale microscopie (3D DNA FISH) is de meest directe manier om de locatie van genloci, chromosomale deelgebieden of gehele grondgebied in individuele cellen te visualiseren. Dit type analyse geeft inzicht in de globale architectuur van de kern en het gedrag van specifieke genomische loci en gebieden binnen de nucleaire ruimte. Immunofluorescentie, anderzijds, voor het vaststellen van nucleaire eiwitten (gemodificeerde histonen, histon varianten en modifiers, transcriptiemachinerie en factoren, nucleaire subcompartimenten, etc). De grote uitdaging in combinatie immunofluorescentie en 3D DNA FISH is enerzijds aan de epitoop herkend door het antilichaam en de 3D structuur van de kern te behouden en anderzijds, zodat de penetratie van de DNA probe te detecteren genloci of chromosoom gebieden 1 tot 5. Hier bieden wij een protocol dat visualisatie van chromatine modificaties met genomische loci in 3D bewaarde kernen combineert.
Introduction
Epigenetische mechanismen trekker vestiging en overerving van ontwikkelings-en cel-type specifieke transcriptionele profielen. Op een bepaald niveau gaat het om de modulatie van chromatine verpakking dat de actieve of stille genomische regio's definieert. Op grotere schaal, algemene 3D organisatie van het genoom en nucleaire architectuur een rol spelen in de controle van transcriptionele patronen. Zo dissectie van deze epigenomisch functies is van essentieel belang voor een goed begrip van de manier waarop genen worden gereguleerd 6-11.
Gecombineerd immunofluorescentie en 3D DNA FISH bieden een unieke gelegenheid om moleculaire en biochemische analyses aan te vullen met het beoordelen van specifieke interacties / verenigingen van DNA-sequenties en / of eiwitten in de kern. Bovendien, terwijl genoom-brede high throughput technieken zoals chromatine immunoprecipitatie (ChIP-seq) of chromosoom capture conformatie in combinatie met diepe sequencing (4C-seq, 5C, Hi-C) bieden wereldwijde thateen op celpopulaties 12, immunofluorescentie / DNA FISH technieken maken van de analyses op de enkele cel niveau.
Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno FISH). Het voordeel van dit protocol is de gecombineerde visualisatie van DNA en behoud van eiwitstructuren. Onze ervaring op dit gebied heeft ons in staat te verbeteren en vereenvoudiging van de bestaande protocollen. Hoewel we hebben dit protocol DNA dubbelstrengs breuken gedetecteerd in lymfocyten ondergaan recómbinatie, kan deze werkwijze worden toegepast op andere eiwitten en andere celtypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierboven beschreven technieken werden in ons laboratorium van de regulering van V (D) J recombinatie van het immunoglobuline en Tcra / d loci in ontwikkeling lymfocyten 30,31 analyseren. We zijn ervan overtuigd dat deze techniek kan worden aangepast voor detectie van verschillende nucleaire eiwitten, nucleaire compartimenten en loci, in verschillende celtypen. Wijzigingen van het protocol noodzakelijk zijn, en in dit geval de belangrijke stappen te concentreren op de volgende. Ten eerste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de leden van de Skok lab, in het bijzonder Susannah Hewitt, bedanken voor discussies en commentaar. Dit werk wordt ondersteund door de National Institute of Health subsidies R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS is een Leukemia & Lymphoma Society geleerde. JC is een Irvington Instituut Fellow van het Cancer Research Institute. MM wordt ondersteund door een National Science Foundation Grant Integratieve Graduate Onderwijs en Onderzoek Traineeship (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. |
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories–a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus – charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3′ Igk enhancer induces ‘decontraction’ of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus ‘decontraction’ and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
