Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-DNA FISH).
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Articolo metodologico
Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ibridazione fluorescente in situ con l'utilizzo di sonde a DNA, il 3-dimensionale nuclei conservati seguito da 3D microscopia confocale (FISH DNA 3D) rappresenta il modo più diretto per visualizzare la posizione di loci genici, cromosomica sub-regioni o interi territori in celle singole. Questo tipo di analisi permette di comprendere meglio l'architettura globale del nucleo e il comportamento dei loci genomici e regioni nello spazio nucleare. Immunofluorescenza, invece, permette la rilevazione di proteine nucleari (istoni modificati, varianti istoniche e modificatori, macchinari e fattori di trascrizione nucleari, sotto-compartimenti, ecc). La sfida in combinazione FISH DNA immunofluorescenza e 3D è, da un lato di preservare l'epitopo riconosciuto dagli anticorpi così come l'architettura 3D del nucleo, e dall'altro, per consentire la penetrazione della sonda di DNA per rilevare loci genici o territori cromosomici 1-5. Qui forniamo un protocollo che combina la visualizzazione di modificazioni della cromatina con loci genomici in 3D nuclei conservato.
Introduzione
Epigenetica meccanismi di creazione di trigger e l'eredità di profili specifici di sviluppo e delle cellule di tipo trascrizionale. A un certo livello si tratta di modulazione degli imballaggi cromatina che definisce regioni genomiche attive o in silenzio. Su una scala più ampia, globale organizzazione 3D del genoma e architettura nucleare anche svolgere un ruolo nel controllo trascrizionale di modelli. Così, la dissezione di queste caratteristiche epigenomic è essenziale per una piena comprensione di come i geni sono regolati 6-11.
Combinato FISH DNA immunofluorescenza e 3D offrono una possibilità unica per integrare le an....
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Protocollo
1. DNA Etichettatura Sonda con Fluorofori: Nick Traduzione (~ 6 ore)
- Pulito BAC DNA (preparato da maxi-prep) o plasmidi o prodotti PCR, tutti risospeso in H 2 O, possono essere utilizzati per l'etichettatura. Noti che per un segnale FISH robusta, le sonde devono estendersi almeno 10 kb.
- Incubare DNA in RNasi A per 30 min a 37 ° C (Tutti i reagenti sono elencati nella Tabella 1).
- Incubare la reazione traduzione nick per 2 ore a 16 ° C (vedi tabelle 2 e 3). Metodi alternativi di etichettatura diretta può essere utilizzato (esempio: Tag FISH, Invitrogen).
- Inattivar....
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Risultati
DNA e immuno-FISH vengono utilizzate in laboratorio Skok di studiare le variazioni dell'organizzazione nucleare associati al processo di V (D) J ricombinazione dei loci recettore per l'antigene durante lo sviluppo dei linfociti B e T. Le tecniche sopra descritte ci permettono di i) misurare le distanze tra le due estremità di un locus (contrazione), ii) misurare le distanze tra alleli o loci (pairing), iii) analizzare il danno al DNA che si verificano all'interno loci, iv) verificare la posizione degli allel.......
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Discussione
Le tecniche sopra descritte sono state usate nel nostro laboratorio per analizzare la regolazione di V (D) J ricombinazione delle immunoglobuline e TCRA / d loci nello sviluppo linfociti 30,31. Siamo certi che questa tecnica può essere adattata per il rilevamento di varie proteine nucleari, vani loci nucleari e, in diversi tipi di cellule-. Modifiche del protocollo può essere necessario, e in questo caso le fasi principali di concentrarsi su sono i seguenti. Primo, la lunghezza di permeabi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Skok, soprattutto Susannah Hewitt, per le discussioni e commenti. Questo lavoro è supportato dal National Institute of sovvenzioni Salute R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS è un Leukemia & Lymphoma Society studioso. JC è un Fellow Irvington Istituto del Cancer Research Institute. MM è supportato da una formazione National Science Foundation Graduate Concessione Integrativa e tirocinio di ricerca (NSF IGERT 0333389).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente / materiale | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| H 2 O | Pescatore | # BP2470 | |
| RNasi A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 a C-11401 | |
| Cy3 o Cy5 dUTP | Pescatore | # 45-001-xxx | |
| DNasi I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0,025 micron filtri | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg / ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmone sperma | Sigma | # D1626 | polvere da risospese a 10 mg / ml in H 2 O |
| NaAc (Acetato di sodio, pH 5.2, soluzione tampone) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grado) | Pescatore | # 525 | |
| Polivinilpirrolidone (Mol Biol grado) | Pescatore | # BP431 | |
| Destrano solfato polvere | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodio Fosfato-EDTA) soluzione 20x | Pescatore | # BP1328 | |
| Formammide | Pescatore | # BP227 | |
| Coprioggetto | Pescatore | # 12-548-B | |
| Diapositive | Pescatore | # 12-550 | |
| 6-pozzetti | Pescatore | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Pescatore | # MT-46-013-CM | |
| Poli-L-lisina soluzione | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldeide, granuli, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (albumina di siero bovino) Frazione V | Pescatore | # BP 1600 | |
| Siero di capra normale | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (citrato di sodio Saline) 20x soluzione | Pescatore | # BP1325 | |
| Prolungare reagente Oro antifade | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-Diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Miglior prova di uno strato di cemento di gomma | D'arte o in ufficio di approvvigionamento negozi | ||
| Tabella 1. Reagenti specifici e piccole attrezzature. |
Riferimenti
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al.
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Ristampe e permessi
