Kombinert Immunofluorescence og DNA FISH på 3D bevarte Interphase Nuclei å studere endringer i 3D Nuclear Organization
Summary
Her beskriver vi en protokoll for samtidig påvisning av histonmodifikasjonene ved immunfluorescens og DNA-sekvenser av DNA fisk etterfulgt av 3D mikroskopi og analyser (3D immuno-DNA FISH).
Abstract
Fluorescerende in situ hybridisering med DNA-prober på 3-dimensjonalt bevart kjerner etterfulgt av 3D konfokalmikroskopi (3D DNA FISH) representerer den mest direkte måten å visualisere plasseringen av genloci, kromosomal subregioner eller hele områder i enkeltceller. Denne typen analyse gir et innblikk i global arkitektur av kjernen så vel som virkemåten av spesifikke genomisk loci og regioner innenfor kjernefysiske plass. Immunfluorescens, på den annen side, tillater påvisning av kjernefysiske proteiner (modifiserte histoner, histone varianter og modifikatorer, transkripsjon maskiner og faktorer, kjernefysiske sub-avdelinger, etc). Den største utfordringen i å kombinere immunfluorescens og 3D DNA FISH er, på den ene side for å bevare epitopen detektert av antistoffet samt 3D arkitekturen av kjernen, og på den annen side, for å tillate inntrengning av DNA probe for å påvise genloci eller kromosom territorier 1-5. Her tilbyr vi en protokoll som kombinerer visualisering av kromatin modifikasjoner med genomisk loci i 3D bevart kjerner.
Introduction
Epigenetic mekanismer utløser etablering og arv av utviklings-og celle-type spesifikke transkripsjonelle profiler. På ett nivå innebærer dette modulering av kromatin emballasje som definerer aktive eller stille genomisk regioner. I større målestokk, global 3D organisering av genomet og kjernefysisk arkitektur også spille en rolle i kontroll av transkripsjonelle mønstre. Dermed er disseksjon av disse epigenomic funksjoner avgjørende for en full forståelse av hvordan genene reguleres 6-11.
Kombinert immunfluorescens og 3D DNA FISH gir en unik mulighet til å utfylle biokjemiske og molekylærbiologiske analyser ved å vurdere konkrete interaksjoner / foreninger av DNA-sekvenser og / eller proteiner i kjernen. Videre, mens genom-wide høy gjennomstrømning teknikker som kromatin immunoutfelling (chip-seq) eller kromosom fangst konformasjon kombinert med dyp sekvensering (4C-seq, 5C, Hi-C) gi global data på cellepopulasjoner 12, immunofluorescence / DNA FISK teknikker gjør analyser på enkelt celle-nivå.
Her beskriver vi en protokoll for samtidig påvisning av histonmodifikasjonene ved immunfluorescens og DNA-sekvenser av DNA fisk etterfulgt av 3D mikroskopi og analyser (3D immuno-FISH). Fordelen med denne protokollen er den kombinerte visualisering av DNA og bevaring av proteinstrukturer. Vår erfaring på dette feltet har gitt oss mulighet til å forbedre og forenkle eksisterende protokoller. Selv om vi har brukt denne protokollen for å oppdage DNA dobbel-strandet pauser i lymfocytter gjennomgår rekombinasjon, kan denne metoden brukes på andre proteiner og andre celle-typer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikkene beskrevet ovenfor ble brukt i vårt laboratorium for å analysere reguleringen av V (D) J-rekombinasjon av immunoglobulin og Tcra / d loci i utviklingen lymfocytter 30,31. Vi er sikre på at denne teknikken kan tilpasses for påvisning av ulike kjernefysiske proteiner, kjernefysiske avdelinger og loci, i ulike celle-typer. Modifikasjoner av protokollen kan være nødvendig, og i dette tilfellet de viktigste trinnene å fokusere på er følgende. Først, kan lengden permeabilizatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke medlemmene av Skok lab, spesielt Susannah Hewitt, for diskusjoner og kommentarer. Dette arbeidet er støttet av National Institute of Health tilskudd R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS er en Leukemi og lymfom Society forsker. JC er en Irvington Institute Fellow ved Cancer Research Institute. MM er støttet av National Science Foundation Grant Integrative Graduate Utdannings-og forskningsdepartementet Praksisplass (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. |
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories–a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus – charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3′ Igk enhancer induces ‘decontraction’ of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus ‘decontraction’ and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
