Immunofluorescence combinés et FISH ADN sur 3D préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans l'organisation nucléaire 3D
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d'ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D (3D et des analyses immuno-FISH ADN).
Abstract
Hybridation fluorescente in situ utilisant des sondes ADN sur le 3-dimensions noyaux conservés suivie par microscopie confocale 3D (FISH ADN 3D) représente le moyen le plus direct pour visualiser l'emplacement des loci de gènes, chromosomes sous-régions ou des territoires entiers dans des cellules individuelles. Ce type d'analyse permet de mieux comprendre l'architecture globale du noyau ainsi que le comportement des loci génomiques spécifiques et des régions dans l'espace nucléaire. Immunofluorescence, d'autre part, permet la détection des protéines nucléaires (histones modifiées, variants d'histones et des modificateurs, des machines et des facteurs de transcription nucléaires, sous-compartiments, etc.) Le problème majeur en combinant FISH ADN immunofluorescence et 3D est, d'une part, de préserver l'épitope détecté par l'anticorps, ainsi que l'architecture 3D du noyau, et d'autre part, pour permettre la pénétration de la sonde d'ADN pour détecter loci chromosomiques ou territoires 1-5. Ici, nous fournissons un protocole qui combine la visualisation des modifications de la chromatine avec loci génomiques conservées dans les noyaux 3D.
Introduction
Épigénétique mise en place de mécanismes de déclenchement et l'héritage de développement et d'un type de cellule spécifique profils transcriptionnels. À un certain niveau, cela implique la modulation de empaquetage de la chromatine qui définit des régions génomiques actifs ou silencieux. À plus grande échelle, l'organisation mondiale de la 3D et de l'architecture du génome nucléaire jouent également un rôle dans le contrôle des motifs de la transcription. Ainsi, la dissection de ces caractéristiques épigénomiques est essentielle pour une compréhension complète de la façon dont les gènes sont régulés 6-11.
Combiné FISH ADN immunofluorescence et 3D offrent une occasion unique de compléter les analyses moléculaires et biochimiques en évaluant les interactions spécifiques / associations de séquences d'ADN et / ou de protéines dans le noyau. En outre, alors que l'ensemble du génome techniques à haut débit tels que immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) ou la conformation de capture chromosome couplé avec le séquençage profond (4C-seq, 5C, Salut-C) fournir dat mondialeun sur 12 populations de cellules, les techniques d'immunofluorescence POISSON / ADN permettre des analyses au niveau de la cellule unique.
Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d'ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D et des analyses (3D immuno-FISH). L'avantage de ce protocole est la visualisation combinée de l'ADN et la préservation de la structure des protéines. Notre expérience dans ce domaine nous a permis d'améliorer et de simplifier les protocoles existants. Bien que nous ayons utilisé ce protocole pour détecter l'ADN des cassures double brin dans les lymphocytes subissent une recombinaison, cette méthode peut être appliquée à d'autres protéines et d'autres types de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les techniques décrites ci-dessus ont été utilisées dans notre laboratoire pour analyser la réglementation de V (D) J de l'immunoglobuline et TCRA / j loci dans le développement des lymphocytes 30,31. Nous sommes convaincus que cette technique peut être adaptée pour la détection de diverses protéines nucléaires, des compartiments nucléaires et les lieux, dans différents types cellulaires. Modifications du protocole peut être nécessaire, et dans ce cas les étapes majeures …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Skok, surtout Susannah Hewitt, de discussions et de commentaires. Ce travail est soutenu par l'Institut national de la santé subventions R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS est une leucémie et érudit Lymphoma Society. JC est un Fellow Irvington Institut de la recherche sur le cancer Institut. MM est soutenu par une éducation National Science Foundation Grant universitaire intégré et des stages de recherche (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. |
References
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