Kombinerad Immunfluorescens och DNA FISH på 3D bevarade interfaskärnorna att studera förändringar i 3D Nuclear organisation
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för samtidig detektion av histon ändringar genom immunofluorescens och DNA-sekvenser med DNA-FISK följt av 3D mikroskopi och analyser (3D immuno-DNA FISH).
Abstract
Fluorescent in situ hybridisering med DNA-sonder på 3-dimensionellt bevarade kärnor följt av 3D konfokalmikroskopi (3D-DNA FISH) är det mest direkta sättet att visualisera placeringen av genloci, kromosomal delregioner eller hela territorier i enskilda celler. Denna typ av analys ger en inblick i den globala arkitekturen i kärnan samt uppförande av specifika genomiska loci och regioner inom den nukleära utrymmet. Immunofluorescens, å andra sidan, för detektering av nukleära proteiner (modifierade histoner, histon varianter och modifieringsmedel, transkription maskiner och faktorer, nukleära sub-fack, etc). Den stora utmaningen att kombinera immunofluorescens och 3D-DNA FISK är, å ena sidan för att bevara den epitop som detekteras av antikroppen såväl som 3D-arkitektur av kärnan, och å andra sidan, för att tillåta penetrering av DNA-prob för att detektera genloci eller territorier kromosom 1-5. Här erbjuder vi ett protokoll som kombinerar visualisering av kromatin ändringar med genomiska loci i 3D bevarade kärnor.
Introduction
Epigenetiska mekanismer utlöser etablering och arv av utvecklings-och celltyp specifika transkriptionella profiler. På en nivå handlar det modulering av kromatin förpackningar som definierar aktiva eller tysta genomiska regioner. På en större skala, den globala 3D organisation av genomet och nukleära arkitektur spelar också en roll i kontrollen av transkriptionella mönster. Således är dissektion av dessa epigenomic funktioner nödvändiga för en fullständig förståelse av hur gener regleras 6-11.
Kombinerad immunofluorescens och 3D-DNA FISH ger en unik möjlighet att komplettera molekylära och biokemiska analyser genom att bedöma specifika interaktioner / sammanslutningar av DNA-sekvenser och / eller proteiner i kärnan. Vidare, medan genomet hela hög kapacitet tekniker såsom kromatin immunoprecipitation (chip-seq) eller kromosom fånga konformation i kombination med djup sekvensering (4C-seq, 5C, Hi-C) ger den globala data på cellpopulationer 12, immunofluorescens / DNA FISH teknik möjliggör analyser på en enda cell nivå.
Här beskriver vi ett protokoll för samtidig detektion av histon ändringar av immunofluorescens och DNA-sekvenser med DNA-FISK följt av 3D mikroskopi och analyser (3D immuno-FISH). Fördelen med detta protokoll är den kombinerade visualisering av DNA och bevarande av proteinstrukturer. Vår erfarenhet på detta område har gjort det möjligt för oss att förbättra och förenkla existerande protokoll. Även om vi har använt detta protokoll för att upptäcka DNA dubbelsträngade avbrott i lymfocyter som genomgår rekombination, kan denna metod tillämpas på andra proteiner och andra celltyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
De tekniker som beskrivs ovan användes i vårt labb för att analysera regleringen av V (D) J-rekombination av immunglobulin och Tcra / d loci utveckla lymfocyter 30,31. Vi är övertygade om att denna teknik kan anpassas för detektion av olika nukleära proteiner, nukleära fack och loci i olika celltyper. Ändringar av protokollet kan vara nödvändigt, och i detta fall de viktigaste stegen för att fokusera på är följande. Först, kan längden på permeabilisering justeras beroende p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmarna i Skok labbet, speciellt Susannah Hewitt, för diskussioner och kommentarer. Detta arbete stöds av National Institute of Health bidrag R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS är en Leukemia & Lymphoma Society forskare. JC är en Irvington institut kamrat av Cancer Research Institute. MM stöds av National Science Foundation integrativ forskarutbildning och forskning Praktik (NSF IGERT 0.333.389).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. |
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories–a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus – charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3′ Igk enhancer induces ‘decontraction’ of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus ‘decontraction’ and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
