Cryosectioning Gist Gemeenschappen is voor de behandeling Fluorescentie Patterns
Summary
We presenteren een protocol voor het invriezen en cryosectioning gist gemeenschappen om interne patronen van fluorescerende cellen te observeren. De methode is gebaseerd op methanol-fixing en OCT-inbedding van de ruimtelijke verdeling van cellen te behouden zonder het inactiveren van fluorescerende eiwitten binnen een gemeenschap.
Abstract
Microben typisch leven in gemeenschappen. De ruimtelijke organisatie van cellen in een gemeenschap wordt verondersteld om de overleving en functie van de gemeenschap 1 beïnvloeden. Optische sectie technieken, met inbegrip van confocale en twee-foton microscopie, nuttig zijn gebleken voor het observeren van ruimtelijke organisatie van bacterien en archaea gemeenschappen 2,3. Een combinatie van confocale beeldvorming en fysische snijden van gistkolonies blijkt interne organisatie van cellen 4. Heeft echter directe optische sectie met behulp van confocale of twee-foton microscopie geweest alleen in staat om een paar cellagen diep in gist kolonies te bereiken. Deze beperking is waarschijnlijk vanwege sterke lichtverstrooiing uit gistcellen 4.
Hier presenteren we een methode op basis van de vaststelling en cryosectioning tot ruimtelijke verdeling van fluorescerende cellen te verkrijgen in Saccharomyces cerevisiae gemeenschappen. We gebruiken methanol als fixeermiddel agensde ruimtelijke verdeling van cellen behouden. Vaste gemeenschappen worden geïnfiltreerd met OCT verbinding, bevroren, en cryosectioned in een cryostaat. Fluorescentie beeldvorming van de secties onthult de interne organisatie van fluorescerende cellen binnen de gemeenschap.
Voorbeelden van gist gemeenschappen bestaande uit stammen die rood en groen fluorescerende eiwitten vertonen de potentialen van de cryosectioning methode om de ruimtelijke verdeling van fluorescerende cellen onthullen evenals die van genexpressie in gistkolonies 2,3. Hoewel onze nadruk lag op Saccharomyces cerevisiae Gemeenschappen kan dezelfde werkwijze mogelijk worden toegepast op andere microbiële onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De procedure hier gepresenteerde biedt een manier om de interne structuur van gist gemeenschappen te inspecteren. De methanol fixeerstap maakt de gistkolonie starre 8 en bewaart de integriteit van de kolonie, maar veroorzaakt ook krimp 8 die moet worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten. We meestal zien rond de 30% krimp in de hoogte van gist kolonies, in vergelijking met kolonies rechtstreeks ingebed in OCT zonder bevestiging 9.
Om te vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Jonathan Cooper Lab bij Fred Hutchinson Cancer Research Center bedanken voor de toestemming om hun cryostaat te gebruiken. Dit werk werd ondersteund door NIH en de WM Keck Foundation. BM is een Gordon en Betty Moore fellow van Life Science Research Foundation. We zijn dankbaar voor Daniel Gottschling voor het delen van zijn bevestiging protocol met ons op.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , (2012).
- Kiernan, J., ed, . Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
