글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정
Summary
지속성 길이 또는 biopolymers의 굽힘 강성을 측정 할 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 실험적으로 개별 미소의 지속성 길이를 결정하는 kinesin 기반 미세 소관 글라이딩 분석을 사용하고 고를 기반 글라이딩 assays에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
미소는 cytoskeletal 세포 분열에 역할을 고분자, 세포 역학, 그리고 세포 내 수송 있습니다. 이 함수는 각각 뻣뻣하고 세포 직경의 중요한 일부를 기간을 직선 충분 미소가 필요합니다. 그 결과, 미세 소관 지속성 길이, 강성의 측정은 적극적으로 지난 20 년 1 연구되었습니다. 짧은 미소 긴 미소 2-4보다 10-50 배 더 치열한 있으며, 심지어 긴 미소는 진도 5-9의 순서에 따라 다를 수 지속성 길이를 측정했습니다 그럼에도 불구하고, 오픈 질문이 남아있다.
여기, 우리는 미세 소관 지속성 길이를 측정하는 방법을 제시한다. 방법은 kinesin 기반 미세 소관 글라이딩 분석 10를 기준으로합니다. 미세 소관에 부착 된 개인 fluorophores의 단일 입자 추적, glidin과 개별 미소의 스파 스 형광 라벨을 결합하여하나 미소의 g의 탄도는 나노 미터 수준의 정밀도로 추적합니다. 궤도의 지속성 길이는 11 사용 조건에서 미세 소관의 지속성 길이와 동일합니다. 자동화 된 추적 루틴은 개별 미소에 첨부 fluorophores에서 미세 소관의 탄도를 만드는 데 사용되는,이 탄도의 지속성 길이를 IDL로 작성된 루틴을 사용하여 계산됩니다.
이 기술은 빠르게 implementable, 그리고 실험 하루에 100 미소의 지속성 길이를 측정 할 수 있습니다. 방법은 미소를 따라 길이의 함수로 지속성 길이 등의 다양한 조건 아래에서 지속성 길이를 측정하기 위해 확장 될 수 있습니다. 또한, 사용 된 분석 루틴은 잘 고를의 필라멘트의 지속성 길이를 측정하기 위해, 마이 오신 기반의 연기 글라이딩 assays로 확장 할 수 있습니다.
Introduction
세포 골격은 대부분의 진핵 세포에서 발견 biopolymers의 네트워크, 휴대 조직, 세포 내 수송과 세포 역학의 역할을합니다. 세포 골격 (주로 고를와 미소)의 biopolymers의 기계적 특성은 전체 12 세포의 기계적 특성을 결정에 중요한 역할을한다. 전체 세포 역학이 건강하고 병에 걸린 세포에게 13,14을 특성화 할 수 있으며 세포 운동성 15에 관여되어 있기 때문에, 기본 cytoskeletal 구성 요소의 기계적 성질은 지난 20 년 1 연구의 활성 영역했습니다.
biopolymers의 유연성 (또는 강성)은 지속성 길이, 주위 온도에서 열 변동에 따라 약 방 사부에 의해 구부러 폴리머의 길이에 의해 특징입니다. 기술의 수는 examp에 대한 지속성 길이 16, 측정하기 위해 개발되었습니다유체 흐름, 광학 트랩, 또는 전기 분야 4,17,18, 및 솔루션 5,6에서 무료로 고분자의 변동을 측정 수동적 인 기술을 사용하여 폴리머를 절곡 참여 르중인 기술. 활성 측정 단, 전문 설정은 마이크로 미터 규모라고 힘을 구현하도록 요구하고, 자유 변동 측정은 사용 현미경의 초점 비행기의 확산 아웃으로 인해 도전 할 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 미소의 지속성 길이, cytoskeletal 폴리머를 측정 할 수있는 보완, 수동, 기술에 대해 설명합니다. 기술은 폴리머는 항상 19 초점 비행기에 남아 있도록 글라이딩 assays를 포함합니다. 또한,이 폴리머 따라 특정 위치가 잘 특징 있도록 관심 폴리머에 영구적으로 부착 된 추적 한 fluorophores을 포함합니다.
방법의 만화는 Figur에 표시됩니다E 1. Kinesin는 미소의 + 끝으로 구체적으로 이동하므로 글라이딩 분석에 미소가 unidirectionally 추진되어 있습니다. 미세 소관의 선두 끝은 첨부 마지막 kinesin 넘어, 주변 솔루션의 열 군사 변동 할 수있다. 미세 소관이 앞으로 추진되면서 끝은 유리 슬라이드를 따라 더 새로운 kinesin 분자에 바인딩 할 때까지 주어진 변동에 정지 다를 수 있습니다. kinesin가 매우 강력하게 미소를 연결하기 때문에, 미세 소관은 선도적 인 엔드의 경로를 따라 제한됩니다. 따라서 미세 소관 궤도에 냉동 통계 변동 미소 (11)의 자유 단의 통계 변동과 동일합니다, 따라서 20에 따라 지속성 길이를 계산하는 데 사용할 수 있습니다
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리터 P는 미세 소관의 지속성 길이이고, θ s이 (가) 등고선의 길이 S로 구분하여 궤도에 접선 사이의 각도이며, <> 존재라는 증거 윤곽 길이의로 구분하여 위치의 모든 쌍 이상의 평균.
글라이딩 분석 자체는 특별히 streptavidin – 비오틴의 연계를 통해 유리 슬라이드에 바인딩 된 코일 코일 21시 kinesin biotinylated 사용합니다. 이 첨부 파일은 모터 도메인에 바인딩하고 미소를 추진 자유롭게 보장합니다. 미세 소관의 탄도를 따라하기 위해, 미소가 띄엄 띄엄 유기 fluorophores 22,23으로 분류됩니다 – 라벨 하나 fluorophores는 단일 분자 형광 현미경을 사용하여 확인할 수있는 것을 충분히 희박한해야합니다. 싱글 fluorophores은 IDL로 작성된 이미지 분석 루틴을 사용하여 추적하고 있습니다. 각 형광의 궤도는 주어진 마이크에 바인딩rotubule은 자동으로 24 복합 미세 소관 궤도로 결합되어 있습니다. 궤도를 따라 각 지점에 θ 탄젠트 각도가 계산되며,이 접하는 각도에서 <cosθ S> 값이 각 등고선의 길이 s에 대한 계산됩니다. 마지막으로, 이러한 데이터는 EQ에 맞게되어 있습니다. 1 주어진 미세 소관에 대한 지속성 길이를 추출하기 위해, 또는 같은 글라이딩 분석에 많은 미소를위한.
방법은 조건의 다양한 (행 미세 소관 관련 단백질 (지도)이나 점성 솔루션의 다양한, 미세 소관에 바인딩 된 다른 안정화 대리인 또는 다른 작은 분자 포함)에서 조리 미소와 함께 일을 할 수있을만큼 강력합니다. 우리가 실험실에서, 기술은 다른 안정화 에이전트와 미소와 미소를 따라 길이의 함수로 미소의 지속성 길이를 특성화하는 데 사용되었습니다. 주요 제한은 미소는 여전히해야upport kinesin의 운동성. kinesin는 강력한 모터 효소이기 때문에이 상당히 느슨한 제한됩니다. 마이 오신 가족 효소를 고를와 kinesin과 미소를 대체함으로써, 고를의 지속성 길이가 같은 기술을 사용하여 측정 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지속성 길이 측정은 개별 biopolymers의 기계적 성질의 좋은 특성입니다. 이 문서에서는, 우리는 미소의 지속성 길이를 측정하는 방법을 설명합니다. 으로 도입에 명시된 바와 같이,이 방법은 쉽게 간단하게 글라이딩 검정, 3.9의 최종 단계에서 시약, 온도, 또는 점도를 변화하거나 polymerizing 미소, 스텝 1.1의 다양한 조건에 미세 소관 기계적 특성을 조사에 연장됩니다 다른 조건 하에서.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 지원이 프로토콜을 시연을 위해 그림 1과 안나 Ratliff를 준비 멜리사 Klocke 감사드립니다. 이 작품은 과학 발전을위한 연구 법인에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
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