إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية
Summary
الدراسات البيوكيميائية البيوفيزيائية والتفاعلات بين المجالات بروتين الغشاء جزءا لا يتجزأ من مواجهة التحديات التقنية كثيرة، وأولها هو الحصول على المواد المناسبة الدراسة. توضح هذه المقالة بروتوكول لإنتاج وتنقية ثاني كبريتيد-استقرت المجمعات الببتيد عبر الغشاء التي هي مناسبة لتحليل الهيكلية التي كتبها صدى حل المغناطيسي النووي (NMR) والتطبيقات التحليلية الأخرى.
Abstract
التفاعلات الجسدية بين المجالات ألفا حلزونية للدهون، بروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من لعب دورا حاسما في للطي والتجمع مجمعات البروتين غشاء والعمليات الدينامية في مثل عبر الغشاء (TM) إشارات وتنظيم مستويات البروتين على سطح الخلية. فهم السمات الهيكلية قيادة رابطة تسلسل معين يتطلب تحليلات متطورة البيوكيميائية البيوفيزيائية والمجمعات الببتيد TM. ومع ذلك، فإن hydrophobicity متطرفة من المجالات TM يجعل من الصعب جدا على التعامل مع تقنيات الكيمياء باستخدام معيار الببتيد، وإنتاج المواد الدراسية مناسبة غالبا ما يثبت التحدي باهظة. تحديد الظروف التي يمكن أن الببتيدات اعتماد التشكل حلزونية الشكل مستقرة والمجمعات يضيف تلقائيا على مستوى مزيد من الصعوبة. هنا نقدم إجراء لإنتاج وطي أو مثنوي مغاير المجمعات الببتيد TM من المواد التي يتم التعبير عنها في E. مضيق بين قمتينالأول، مما يسمح بإدراج تسميات النظائر المستقرة لالرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو غير الطبيعية الأحماض الأمينية لتطبيقات أخرى غير مكلفة نسبيا. والابتكار الرئيسي في هذا الأسلوب هو أن يتم إنتاج مجمعات TM وتنقيته والتجمعات (ثاني كبريتيد-crosslinked) المرتبطة تساهميا التي يمكن أن تشكل هياكل مستقرة، والقياس المتكافئ متجانسة عندما أعيد إلى الدهون والمنظفات أو غيرها من المواد غشاء المحاكاة. نقدم أيضا إجراءات بعناية الأمثل للتعبير وتنقية التي تنطبق على قدم المساواة سواء المنتجة أو واحدة المجالات TM المجمعات crosslinked وتقديم المشورة للتكيف هذه الأساليب لتسلسل TM الجديدة.
Introduction
تفاصيل هذا البروتوكول إجراء ضعنا لإنتاج ثاني كبريتيد المجمعات استقرت عبر الغشاء من الببتيدات (TM) للدراسات الهيكلية باستخدام NMR الحل. الإجراء يستفيد من التعبير القوي التي يوفرها نظام الانصهار ΔtrpLE1413 (انظر أدناه)، ويسمح إنشاء المجمعات الببتيد TM تكوين المعرفة باستخدام تقنيات متطورة وضع العلامات النظائر مستقرة-NMR لتجارب حديثة متعددة الأبعاد. لقد استخدمنا هذه التقنيات لتحديد هياكل NMR عدة كشفت معلومات جديدة هامة حول كيفية تجميع الخلايا اللمفاوية-تفعيل immunoreceptors من عدة مفارز بروتين الغشاء من خلال التفاعل بين المجالات التي TM (مشاركة مؤخرا في 1). هذه التقنيات قابلة للتطبيق على العديد من أنظمة البروتين الغشاء، فضلا عن مجموعة واسعة من الأساليب التحليلية المصب بالإضافة إلى NMR الحل. في حين أن المثال المذكور هنا يستخدم بقايا السيستين الأصليلإنشاء مجمع الذي يحاكي بشكل طبيعي ثاني كبريتيد العبودي البروتين، وتصميم على ما يرام أيضا مناسبة لخلق السندات ثاني كبريتيد هندسيا لتحقيق الاستقرار في المجمعات التي تقام عادة معا عن طريق أضعف التفاعلات غير التساهمية، مثل هومو ومثنوي مغاير المجمعات TM من البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) بين أفراد الأسرة أو البروتينات 2-4 heterodimeric αβ المجمعات إنتغرين 5،6.
تسلسل الببتيد مسعور للغاية مثل تلك المستمدة من الدهون طبقة ثنائية، والتي تمتد أجزاء من البروتينات TM هي الموضوعات الصعبة للغاية للدراسات كيميائية حيوية والفيزيائية الحيوية. بالإضافة إلى كونها صعبة للغاية لمعالجة باستخدام البروتين القياسية وتقنيات الكيمياء الببتيد، فإنها غالبا ما تكون سامة جدا للخلايا وبالتالي فهي صعبة لإنتاج recombinantly. نحن 7،8 9-11 وغيرها كان لها كبير معربا عن نجاح هذه تسلسل الببتيد الصعب في البكتيريا كما هو الحال في الإطار كربوكسي لمحطةاندماج لنسخة معدلة من تسلسل ΔtrpLE1413 المستمدة من E. القولونية الحزب OPERON 12. يمكن أن تنتج عن ببتيد ~ 13 كيلو دالتون trpLE المشفرة بواسطة هذا التسلسل عند مستويات مرتفعة في ظل المروج T7 ويتم ترجمة تماما لإدراج الهيئات حيث يتم التحايل المشاكل المتعلقة سمية و / أو عدم الاستقرار. تعديل تسلسل إضافة محطة الأمينية 9-13 و الحامض الاميني العلامة القضاء على بقايا ميثيونين الداخلية والسيستين من تسلسل 14 trpLE يسمح trpLE الببتيد اندماج ليكون منقى من قبل اللوني تقارب المعادن ايون وهضمها باستخدام بروميد السيانوجين (CNBr ) للافراج عن تسلسل الببتيد المطلوب. وقد استخدمنا هذا النظام بنجاح للتعبير عن أكثر من اثني عشر سلاسل مختلفة مثل اندماج trpLE تمثل شظايا البروتين غشاء التي تحتوي على ما يصل إلى أربعة مجالات TM (7،8 والنتائج غير المنشورة، وانظر أيضا قسم المناقشات).
الالابتكار الرئيسية في هذا البروتوكول هو تحديد الشروط التي بموجبها غير منظم وقابل للذوبان جدا سيئة trpLE-TM اندماج يمكن أن يكون بكفاءة ثاني كبريتيد-crosslinked في سياق تبسيط العمل. كما تم عدة جوانب ذات الإنتاجية العالية المناولة والتعبير وتنقية المنتجات الببتيد الأمثل بدقة، والتوصيات المقدمة هنا هي نفس القدر من الأهمية لإنتاج ثاني كبريتيد غير crosslinked-(أحادى) منتجات الببتيد TM.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعبير عن trpLE-TM اندماج. في تجربتنا، يتم التعبير عن سوء trpLE-TM اندماج في ثقافة المتوسط الغنية في 37 ° C، والظروف الثقافة الموصوفة هنا أثبتت نجاحها لسلاسل مختلفة تحتوي على العديد من 1-4 TM المجالات مع عائدات تتراوح 50 حتي 150 ملغ / لتر من الانصهار، نقية سليمة. اندماج ترم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم توفير التمويل لهذا العمل من قبل الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (NHMRC المشروع منحة ل1011352 MEC وMJC؛ المستقلة البنية التحتية معاهد البحوث خطة دعم [IRIISS] منحة لWEHI) وحكومة فيكتوريا (VESKI الابتكار زمالة لMEC؛ الفيكتوري الدولة الدعم الحكومي البنية التحتية التشغيلية لWEHI). MEC زميل الملكة اليزابيث الثانية لمجلس البحوث الأسترالية. EFXB يعترف بدعم من برنامج المنح الدراسية هيلدا نورما شوستر في جامعة ملبورن.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer–monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer’s amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
