Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi
Summary
Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Membran proteinlerinin lipid gömülü alfa-sarmal etki arasındaki fiziksel etkileşimleri membran protein komplekslerinin katlama ve montaj ve böyle transmembran (TM) sinyalizasyon ve hücre yüzey proteini seviyelerinin düzenlenmesi gibi dinamik süreçler önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle dizilerinin dernek sürüş yapısal özelliklerini anlama TM peptid komplekslerini sofistike biyofiziksel ve biyokimyasal analizleri gerektirir. Ancak, TM etki aşırı hidrofobik standart peptid kimyası teknikleri kullanarak işlemek için onları çok zorlaştırır, ve uygun eğitim materyalleri üretimi genellikle engelleyici zorlu kanıtlıyor. Peptidler stabil helisel konformasyonları ve form kompleksleri kabul hangi koşullar altında belirlenmesi kendiliğinden zorluk daha ileri bir düzeyi ekler. Burada E. olarak ifade edilmiştir homo-ya da malzemelerden hetero dimerik TM peptid komplekslerini üretimi için bir işlem sunulmaktadır coli, böylece nükleer manyetik rezonans için izotop etiketler (NMR) ya da nispeten pahalı olmayan diğer uygulamalar için, doğal olmayan amino asitler birleşme sağlar. Bu yöntemde önemli yenilik TM kompleksleri üretilen ve deterjan, yağ veya diğer membran-mimetik malzemelerin içine rekonstitüe zaman istikrarlı stokiyometrik ve homojen yapılar oluşturabilirler kovalent ilişkili (disülfid-çapraz) birleştirmeleri olarak saflaştırılmış olmasıdır. Biz de Tekli TM etki veya çapraz kompleksleri üretiminde olsun aynı şekilde uygulanabilir ve yeni TM dizileri için bu yöntemleri adapte etmek için önerilerde ifade ve saflaştırma için özenle optimize prosedürleri sunuyoruz.
Introduction
Bu protokol detayları biz çözüm NMR kullanarak yapısal çalışmalar için disülfid stabilize transmembran kompleksleri (TM) peptidler üretmek için gelişmiş bir prosedür. Prosedür ΔtrpLE1413 füzyon sistemi (aşağıya bakınız) tarafından tanınan sağlam ifade yararlanır ve tanımlanan bileşim TM peptid komplekslerini modern çok boyutlu NMR deneyleri için gelişmiş bir kararlı-izotop etiketleme teknikleri kullanılarak oluşturulmasına olanak sağlar. Biz lenfosit aktive edici immunoreceptors (son 1 yorum) kendi TM alanları arasındaki etkileşim yoluyla birden membran protein alt monte edilen ilgili önemli yeni bilgiler ortaya çeşitli NMR yapılarını belirlemek için bu teknikler istihdam var. Bu teknikler, bir çok başka zar proteini sistemlerinin yanı sıra çözelti NMR ek olarak aşağı analitik yöntemler geniş bir yelpazede için de geçerlidir. Burada verilen örnekte yerli sistein kalıntıları kullanır ikendoğal disülfit-gümrüklü protein taklit eden bir kompleks oluşturmak için, tasarım eşit derecede iyi normalde böyle homo-ve hetero-dimerik TM kompleksleri gibi zayıf, non-kovalent etkileşimler arada tutarak kompleksleri stabilize etmek için tasarlanmış disülfit bağları oluşturmak için uygundur epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ailesi proteinleri 2-4 veya heterodimerik αβ integrin kompleksleri 5,6.
Bu tür lipit türetilmiş olanlar gibi, son derece hidrofobik peptid dizileri kapsayan-çift-katlı TM proteinlerinin kısımlarını biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için son derece zor konusudur. Standart protein ve peptid kimyası teknikleri kullanılarak manipüle etmek çok zor olmasının yanı sıra, genellikle hücreler için oldukça toksik olan ve bu nedenle yeniden birleştirilerek üretmek zordur. Biz 7,8 ve diğerleri 9-11 sahip olan in-frame karboksi-terminal olarak bakteri gibi zor peptid sekansları ifade önemli bir başarıE. türetilen ΔtrpLE1413 dizisinin değiştirilmiş bir versiyonu ile füzyonları coli trp operon 12. Bu sekans ile kodlanan ~ 13 kDa trpLE polipeptid bir T7 promotor altında yüksek düzeyde üretilebilir ve tamamen toksisite ve / veya istikrarsızlık ile ilgili problemler atlatılabilir edilir dahil organları lokalize edilmektedir. Bir amino-terminal 9-histidin etiketi 13 ve trpLE sıra, iç metionin ve sistein kalıntıları ortadan kaldırılması metal iyon afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve sindirildi edilmesi için izin verilen 14 trpLE-peptid füzyonları ve siyanojen bromür (CNBR kullanılarak eklenmesi ile sekans modifikasyonu ) istenen peptid dizisi serbest kalmasını sağlar. Biz başarıyla en fazla dört TM alanları içeren membran proteini parçaları temsil trpLE füzyonlar gibi bir düzine farklı dizilerin daha ifade etmek için bu sistemi kullanılmış (7,8 ve yayınlanmamış sonuçlar; ayrıca TARTIŞMA bölümüne bakınız).
Bu protokolde de önemli bir yenilik yapısal olmayan ve çok az çözünen trpLE-TM füzyonları verimli bir iş akışı bağlamında disülfür-çapraz bağlı olabilir hangi koşullar altında tespit edilmesidir. Yüksek verim ifadesi, taşıma ve peptid ürünlerinin saflaştırılması birkaç yönü de iyice optimize, ve burada sunulan öneriler olmayan disülfit çapraz bağlı (monomerik) TM peptid ürünlerinin üretimi için aynı derecede geçerli olarak oylandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
TrpLE-TM füzyonlar Ekspresyonu. Bizim tecrübelerimize göre, trpLE-TM füzyonlar zayıf 37 ° C'de zengin kültür ortamı olarak ifade edilir, ve burada açıklanan kültür koşullarında verimleri değişen bir ila dört TM etki içeren birçok farklı dizileri için başarısı kanıtlanmış 50 ile 150 mg / saf, bozulmamış füzyon L. Fusions kodlama üç veya dört-TM GPCR parçaları (insan CCR5 sırasıyla TM1-TM3 ve TM4-TM7,) ya da insan sinyal peptit peptidaz (dört TM etki; ref 15) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MEC ve Victoria Hükümeti (Veski Yenilik Fellowship, bu iş için Harçlar Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (WEHI Bağımsız Araştırma Enstitüleri Altyapısını Destekleme Programı [IRIISS] hibe MEC ve MJC için NHMRC proje hibesi 1011352) tarafından sağlanır; WEHI için Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapısını Destekleme). MEC Avustralya Araştırma Konseyi Kraliçe Elizabeth II üyesidir. EFXB Melbourne Üniversitesi'nde Norma Hilda Schuster Burs Programı desteğini onaylar.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer–monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer’s amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
