Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement
Summary
Nous décrivons ici le fonctionnement d'un dispositif microfluidique qui permet l'imagerie microscopique continu et à haute résolution de cellules de levure en herbe simples lors de leur réplication complète et / ou chronologique durée de vie.
Abstract
Nous démontrons l'utilisation d'une configuration microfluidique simple, dans lequel les cellules de levure bourgeonnante simples peuvent être suivis tout au long de leur durée de vie. La puce microfluidique exploite la différence de taille entre les cellules de la mère et la fille en utilisant un tableau de micropads. Lors du chargement, les cellules sont piégées en dessous de ces micropads, parce que la distance entre le Micropad et le verre de couverture est similaire au diamètre d'une cellule de levure (3-4 pm). Après la procédure de chargement, le milieu de culture est constamment balayé par la puce, ce qui non seulement crée un environnement constant et défini tout au long de l'expérience, mais aussi de rincer les cellules filles émergents, qui ne sont pas retenues sous les patins en raison de leur petite taille. La configuration conserve les cellules mères si efficacement que dans une seule expérience jusqu'à 50 cellules individuelles peuvent être surveillés de façon entièrement automatisée pour 5 jours ou, le cas échéant, plus longtemps. En outre, les excellentes propriétés optiques de la puce permettent élevéImagerie de résolution des cellules au cours de la totalité du processus de vieillissement.
Introduction
Bourgeonnement levure est un organisme modèle important pour recherche sur le vieillissement 1. Jusqu'à une date récente étude réplicative vieillissement des cellules de levure a été un processus laborieux nécessitant une méthode de dissection, dans lequel chaque bourgeon a été enlevé manuellement à partir de la cellule mère 2,3. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment présenté une configuration microfluidique roman en mesure de suivre les cellules mères individuels tout au long de leur durée de vie 4.
Dans notre puce microfluidique, les cellules de levure sont piégées sous micropads gazeuses à base d'élastomère (voir Figure 1). Un flux continu de milieu emporte cellules filles nouvellement formés et fournit les cellules avec des nutriments frais. Dans une expérience unique, jusqu'à 50 cellules mères peuvent être contrôlés de manière entièrement automatique pendant toute leur durée de vie réplicative. En raison des excellentes propriétés optiques de la puce microfluidique, il est possible de surveiller simultanément les différents aspects de la biologie de la cellule de levure (par exemple, </em> en utilisant des protéines fluorescentes).
Par rapport à la méthode de dissection classique, la configuration microfluidique offre des avantages substantiels. Elle assure un environnement déterminée et constante pendant toute l'expérience de vieillissement. Il ne nécessite aucun équipement spécialisé coûteux et peut être exécuté sur n'importe quel microscope équipé d'orientation automatisé et des capacités time-lapse ainsi que de contrôle de température pour la culture cellulaire. La production et le fonctionnement des puces microfluidiques peuvent être appris en quelques jours. En outre, les cellules peuvent être chargés directement à partir d'une culture en croissance exponentielle, un avantage sur une autre méthode microfluidique récemment publié 5, qui nécessite biotinylation des cellules mères. Une Combiné avec imagerie à haute résolution, la méthode décrite ici peut être utilisé pour mesurer des changements progressifs dans la morphologie cellulaire, l'expression de protéines et de localisation au cours de la levure du vieillissement d'une manière sans précédent. La capacité desuivi à long terme de cellules individuelles offre également des possibilités uniques pour l'étude du cycle cellulaire de la levure.
Cette méthode a récemment été optimisée pour enlever la biotinylation du protocole 16, qui a été publié alors que ce manuscrit était à l'examen.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici microfluidique est un outil important de roman en recherche sur le vieillissement, car elle permet la production simple et automatisée de levure réplicatif données de durée de vie en combinaison avec l'imagerie en continu à haute résolution. Ces attributs sont les principales améliorations par rapport aux possibilités expérimentales de la méthode de dissection classique, mais il ya quelques limites de la méthode qui doit être pris en compte.
Notez que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Laura Schippers pour écrire les premières versions du protocole de chargement de cellules et Marcus de Goffau et Guille Zampar pour marquer morphologies mitochondriales.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
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