Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe
Summary
Wir beschreiben hier den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine kontinuierliche und hochauflösende mikroskopische Bildgebung einzelner knospenden Hefezellen ermöglicht während ihres kompletten replikativen und / oder chronologischer Lebensdauer.
Abstract
Wir zeigen die Verwendung eines einfachen mikrofluidischen Einrichtung, in der einzelne Hefe-Zellen über die gesamte Lebensdauer verfolgt werden kann. Die Mikrofluidik-Chip nutzt die Größenunterschied zwischen Mutter und Tochter-Zellen mit einer Reihe von micropads. Bei Belastung werden die Zellen unter diesen micropads eingeschlossen, weil der Abstand zwischen der microPad und Deckglas ist ähnlich dem Durchmesser einer Hefezelle (3-4 um). Nach dem Ladevorgang wird Kulturmedium kontinuierlich durch den Chip, der nicht nur eine konstante und definierte Umwelt während des gesamten Experiments gespült, sondern auch spült den Schwellenländern Tochterzellen, die nicht unter den Pads aufgrund ihrer geringeren Größe zurückgehalten werden. Der Aufbau behält Mutter Zellen so effizient, dass in einem einzigen Experiment bis zu 50 einzelne Zellen in einer vollautomatisch während 5 Tagen überwacht werden oder, falls erforderlich, länger. Darüber hinaus ermöglichen die hervorragenden optischen Eigenschaften des Chips hoherAuflösung Bildgebung von Zellen während des gesamten Alterungsprozess.
Introduction
Bäckerhefe ist ein wichtiger Modellorganismus für Alternsforschung 1. Bis vor kurzem Studium replikativen Alterung in Hefezellen ein aufwändiger Prozess erfordern eine Dissektion Verfahren, in dem jeder Keim wurde manuell aus der Mutterzelle 2,3 entfernt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir vor kurzem einen neuen mikrofluidischen Einrichtung der Lage, einzelne Zellen Mutter während ihrer gesamten Lebensdauer 4 verfolgen.
In unserem mikrofluidischen Chips werden Hefezellen unter weichen Elastomer-basierte micropads gefangen (siehe Abbildung 1). Ein kontinuierlicher Strom des Mediums wäscht neu gebildeten Tochterzellen und stellt die Zellen mit frischen Nährstoffen. In einem einzigen Experiment, kann bis zu 50 Mutter-Zellen in einem vollautomatisch während ihrer gesamten Lebensdauer replikativen überwacht werden. Bedingt durch die hervorragenden optischen Eigenschaften des mikrofluidischen Chips, ist es möglich, gleichzeitig zu überwachen verschiedenen Aspekte der Hefezelle biology (zB </em> mit fluoreszierenden Proteinen).
Im Vergleich zu den klassischen Dissektionsverfahren stellt die mikrofluidischen Einrichtung wesentliche Vorteile. Er sorgt für einen definierten und konstanten Umwelt während des gesamten Experiments Alterung. Es erfordert keine teure Spezialausrüstung und kann auf jedem Mikroskop mit automatischer Fokussierung und Zeitraffer-Fähigkeiten sowie Temperatur-Kontrolle zur Zellkultivierung ausgestattet ausgeführt werden. Die Produktion und den Betrieb der mikrofluidischen Chips können in wenigen Tagen erlernt werden. Darüber hinaus können die Zellen direkt aus einer exponentiell wachsenden Kultur, ein Vorteil gegenüber anderen kürzlich veröffentlichten mikrofluidischen Verfahren 5, die Biotinylierung Mutter Zellen erfordert geladen werden. Kombiniert mit einer hochauflösenden Bildgebung, die hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, um graduelle Veränderungen zu messen in zelluläre Morphologie, Alterung Protein Expression und Lokalisation während Hefe in beispielloser Weise. Die Fähigkeit,Langzeit-Monitoring von Einzelzellen bietet auch einzigartige Möglichkeiten für Hefe-Zellzyklus-Studien.
a Diese Methode wurde kürzlich optimiert, um die Biotinylierung von dem Protokoll 16, die veröffentlicht, während dieses Manuskript war in Bewertung wurde entfernen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die mikrofluidischen hier beschriebene Methode ist ein wichtiges Werkzeug in Roman Altersforschung, wie es einfache und automatisierte Erzeugung von Hefe replikativen Lebensspanne Daten in Kombination mit kontinuierlichen hochauflösende Bildgebung ermöglicht. Diese Attribute sind wesentliche Verbesserungen gegenüber den experimentellen Möglichkeiten der klassischen Dissektion Methode, aber es gibt ein paar Einschränkungen der Methode, die berücksichtigt werden müssen.
Beachten Sie, da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Laura Schippers zum Schreiben der ersten Versionen der Zelle Laden Protokoll und Marcus de Goffau und Guille Zampar für Scoring mitochondrialen Morphologie danken.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
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