鉴定<em>睡美人</em>转座子插入连接器介导的PCR实体瘤
Summary
鉴定未知的驱动程序致癌作用的一种方法，用一种公正的方法。该方法使用<em>睡美人</em>转座子作为随机诱变剂，向特定的组织。肿瘤的形成转座子插入驱动的新型癌基因和肿瘤抑制基因的基因组作图
Abstract
人类肿瘤基因组学，蛋白质组学，转录组和表观分析表明，有数以千计相匹配的正常组织相比，在每一个癌症基因组的异常。基于这些分析，这是显而易见的，有许多未被发现的遗传的驱动癌症1。不幸的是，这些驱动程序都隐藏在一个更大数量的乘客异常的基因组不直接促进肿瘤的形成。的癌症基因组的另一个方面是，有相当类似类型的肿瘤内的遗传异质性。每个肿瘤能够携带不同的基因突变，肿瘤形成2提供了一个选择性的优势。执行一个公正的正向遗传筛选的小鼠提供的工具，以产生肿瘤，并分析其遗传组成，同时减少乘客突变的背景。 睡美人 （SB）的转座子系统是其中的一个方法3。 SB系统利用移动vectors（转座子）可以被插入在整个基因组的转座酶。被限制到特定的细胞类型，通过使用一个被激活的Cre重组酶的的条件转座等位基因突变。许多小鼠表达Cre重组酶在特定的组织存在。穿越这些线路的的条件转座等位基因（ 如液氧一站式-LOX-SB11），SB只有在系统被激活细胞表达Cre重组酶 。 Cre重组酶切除停止盒块座的等位基因的表达，从而激活内指定的单元格类型的转座子突变。的SB屏幕发起的繁殖三个株的转基因小鼠，使实验小鼠携带一个条件转座等位基因，多联体转座子，并在组织特异性表达Cre重组酶的等位基因。这些老鼠被允许直到肿瘤形成的年龄和他们变得奄奄一息。老鼠是剖检和基因组DNA是从肿瘤中分离。接着，对基因组DNA进行到链接器介导PCR扩增（LM-PCR），含有SB转座子的基因位点的扩增结果。 LM-PCR进行单一的肿瘤，会导致不同的扩增产物的数百名代表的数百个基因的转座子插入位点包含在一个单一的肿瘤4。在所有肿瘤的转座子插入常见的插入位点（CISS）进行了分析和确定适当的统计方法5。在独联体内的极有可能是癌基因或抑癌基因的基因，被认为是候选癌基因。使用SB系统，以确定候选癌基因的优点是：1）可以很容易地位于转座子的基因组中，因为它的序列是已知的，2）转置可以被定向到几乎任何类型的细胞，和3）的转座子是能够增益和损失的功能突变6。该followi纳克协议介绍了如何制定和执行正向遗传学的屏幕采用了SB转座系统，以确定候选癌基因（ 图1）。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用睡美人转座子系统的正向遗传筛选提供了一种方法识别基因突变，导致癌症的。通过选择合适的启动子控制Cre重组酶在任何诱发突变，SB屏幕识别已知的和新的候选癌基因。
的SB屏幕的成功在很大程度上依赖于用于创建屏幕中选择的小鼠。对于转座子，我们建议使用两种不同的小鼠品系不同的染色体上携带的联体致癌转座子7。选择的组织特异性表…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者想感谢的布兰登Moriarity，大卫Largaespada，在美国明尼苏达大学的文森特景，并在美国爱荷华大学的亚当·杜佩在发展上述协议提供的援助。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
References
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