の同定<em>眠れる森の美女</emリンカ媒介PCRを用いた固形腫瘍>トランスポゾン挿入
Summary
公平なアプローチを用いて、発がんの未知のドライバを識別する方法が記載されている。この方法は、使用し<em>眠れる森の美女</em特定の組織に送らランダム突然変異誘発物質として>トランスポゾン。腫瘍形成を駆動トランスポゾン挿入のゲノムマッピングは小説癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を特定
Abstract
ヒト腫瘍のトランスクリプトーム、プロテオーム、ゲノム、そしてepigenomic分析マッチさせた正常組織と比較してそれぞれの癌ゲノム内の異常の何千ものがあることを示している。これらの分析に基づいて、それが癌1の多くの未知の遺伝子のドライバがあることは明らかである。残念なことに、これらのドライバは、直接腫瘍形成に寄与しないゲノムの乗客の異常数よりはるかに多くの中に隠されています。癌ゲノムの別の局面は、同様の種類の腫瘍内でかなりの遺伝的異質性があるということです。各腫瘍は、腫瘍形成2の選択的優位性を提供する様々な変異を抱くことができます。乗客変異の背景を削減しながら、マウスでの公平なフォワード遺伝子スクリーニングを実行すると、腫瘍を生成し、それらの遺伝子組成を分析するためのツールを提供します。 眠れる森の美女 （SB）トランスポゾンシステムは、そのような方法の一つは3である。 SBシステムは、携帯Vを利用トランスポザーゼ酵素によってゲノム全体に挿入することができectors（トランスポゾン）。突然変異は、Creリコンビナーゼによって活性化されている条件付きトランスポザーゼ対立遺伝子の使用によって特定の細胞型に限定されています。多くのマウス系統では、特定の組織に発現するCreリコンビナーゼが存在する 。条件トランスポザーゼ対立遺伝子（ 例えば LOX-ストップLOX-SB11）にこれらのいずれかの行を交配することにより、SBシステムのみ急行Creリコンビナーゼ細胞内で活性化されています。 Creリコンビナーゼは、消費税ストップカセットをすること、それによって指定されたセル·タイプ内トランスポゾン突然変異誘発を活性トランスポザーゼアレルのブロック式。実験用マウスは、条件付きトランスポザーゼ対立遺伝子、トランスポゾンのコンカテマー、組織特異的Creリコンビナーゼの対立遺伝子を運ぶようにSBの画面は、トランスジェニックマウスの3つの株を育種することによって開始される。これらのマウスは、腫瘍の形になるまで熟成させ、彼らは瀕死の状態になっています。マウスはその後アール解剖およびゲノムDNAは、腫瘍から分離されています。次に、ゲノムDNAは、SBトランスポゾンを含むゲノム遺伝子座の増幅の結果というリンカ媒介PCR（LM-PCR）に供される。単一の腫瘍に対して行わLM-PCRは、単一の腫瘍4トランスポゾン挿入を含むゲノム遺伝子座の数百を表す個別のアンプリコンの数百人になります。すべての腫瘍におけるトランスポゾンの挿入が分析され、共通の挿入部位（CISS）は、適切な統計的手法5を使用して識別されます。 CIS内の遺伝子は癌遺伝子や癌抑制遺伝子である可能性が高い、候補癌遺伝子と考えられている。候補の癌遺伝子を同定するためにSBシステムを使用する利点は次のとおりです、その配列は、2が知られているので、1）トランスポゾンを簡単に移調は、ほぼすべての細胞型に向け、3）トランスポゾンが可能であることができる）ゲノムに配置することができます利得および機能喪失型変異6の両方を導入する。 followingのプロトコルが候補癌遺伝子（ 図1）を識別するために、SBトランスポゾンシステムを用いたフォワード遺伝子スクリーニングを考案し、実行する方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
眠れる森の美女のトランスポゾンシステムを用いたフォワード遺伝子スクリーニングは、癌を引き起こす変異を同定する方法を提供する。任意の素因変異に加えて、Creリコンビナーゼを制御するための適切なプロモーターを選択することで、SBの画面が知られており、小説候補癌遺伝子を識別します。
SBの画面の成功は、画面を作成するために選択したマ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、上記のプロトコルを開発する際に彼らの支援のためのアイオワ大学のBrandenさんモリアリティ、デビッドLargaespada、ミネソタ大学のヴィンセント·ケン、アダムデュピュイに感謝したいと思います。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
References
- Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
- Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Starr, T. K., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon. Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).
- Mueller, P. R., Wold, B. In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Bergemann, T. L., et al. New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens. Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Harnessing transposons for cancer gene discovery. Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).
- Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature. 436, 272-276 (2005).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323, 1747-1750 (2009).
- Keng, V. W., et al. A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma. Nature. 27, 264-274 (2009).
- Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature. 436, 221-226 (2005).
