Identifisering av<em> Sleeping Beauty</em> Transposon Innsettinger i solide svulster ved hjelp Linker-mediert PCR
Summary
En metode for å identifisere ukjente drivere av karsinogenese bruker en Objektive tilnærming er beskrevet. Metoden bruker<em> Sleeping Beauty</em> Transposon som en tilfeldig mutagen rettet mot spesifikke vev. Genomisk kartlegging av transposon innstikk som driver tumor dannelse identifiserer nye onkogener og tumorsuppressorgener
Abstract
Genomisk, proteomikk, transcriptomic, og epigenomic analyser av menneskelige svulster indikerer at det er tusenvis av anomalier innenfor hver kreft genom forhold til matchet normalt vev. Basert på disse analysene er det innlysende at det er mange uoppdagede genetiske bilførere kreft 1. Dessverre disse driverne er skjult i et mye større antall personbiler anomalier i genomet som ikke direkte bidrar til tumordannelse. Et annet aspekt ved kreft genomet er at det er betydelig genetisk heterogenitet innenfor lignende tumortyper. Hver svulst kan havnen forskjellige mutasjoner som gir en selektiv fordel for tumordannelse 2. Utføre en upartisk frem genetisk skjermen i mus gir verktøy for å generere svulster og analysere deres genetiske sammensetning, og samtidig redusere bakgrunnen for personbiler mutasjoner. The Sleeping Beauty (SB) transposon systemet er en slik metode 3. SB-systemet benytter mobil vektorer (transposoner) som kan settes inn gjennom genomet ved transposase enzymet. Mutasjoner er begrenset til en bestemt celletype gjennom bruk av en betinget transposase allel som aktiveres av Cre rekombinase. Mange mus linjer eksisterer som uttrykker Cre rekombinase i bestemte vev. Ved å krysse en av disse linjene i betinget transposase allelet (f.eks Lox-stop-Lox-SB11), er SB-systemet aktiveres bare i celler som uttrykker Cre rekombinase. Den Cre rekombinase vil avgiftsdirektoratet en stopp kassett som blokkerer uttrykk for transposase allelet, og dermed aktivere transposon mutagenese innenfor det angitte celletype. En SB-skjermen er initiert av avl tre stammer av transgene mus slik at de eksperimentelle mus bære en betinget transposase allelet, en concatamer av transposoner, og en vev-spesifikk Cre rekombinase allelet. Disse musene er lov til alder før svulster form og de blir døende. Musene er såobdusert og genomisk DNA ble isolert fra svulster. Deretter blir det genomiske DNA underkastet linker-mediert-PCR (LM-PCR) som resulterer i amplifikasjon av genomisk loci inneholdende en SB transposon. LM-PCR utført på et enkelt svulst vil resultere i hundrevis av distinkte amplikonene representerer hundrevis av genomiske loci inneholdende transposon innsettinger i en enkelt svulst 4. De transposon innsettinger i alle svulster blir analysert og felles Innleggelse (CISS) er identifisert ved hjelp av en hensiktsmessig statistisk metode 5. Gener innenfor CIS er svært sannsynlig å være onkogener eller tumorsuppressorgener, og anses kandidat kreftgener. Fordelene med å bruke SB system for å identifisere kandidat kreftgener er: 1) den transposon lett kan lokaliseres i genomet fordi dens sekvens er kjent, 2) innarbeiding kan rettes til nesten hvilken som helst celle type og 3) den er i stand til transposon innføre både gevinst-og tap-av-funksjon mutasjoner 6. Den følgende områderng protokollen beskriver hvordan å utvikle og gjennomføre en fremskutt genetisk skjerm bruker SB transposon system for å identifisere kandidat kreftgener (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
En forward genetisk skjermbildet ved hjelp av Sleeping Beauty transposon gir en metode for å identifisere mutasjoner som forårsaker kreft. Ved å velge riktig arrangøren å kontrollere Cre rekombinase i tillegg til eventuelle disponerende mutasjoner, vil SB-skjermen identifisere kjente og nye kandidat kreftgener.
Suksessen til en SB-skjermen er i stor grad avhengig av mus valgt for å skape skjermen. For transposon, anbefaler vi at du bruker to ulike musestammer bærer c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Branden Moriarity, David Largaespada, og Vincent Keng ved University of Minnesota, og Adam Dupuy ved Universitetet i Iowa for deres hjelp i å utvikle protokollen beskrevet ovenfor.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
References
- Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
- Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Starr, T. K., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon. Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).
- Mueller, P. R., Wold, B. In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Bergemann, T. L., et al. New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens. Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Harnessing transposons for cancer gene discovery. Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).
- Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature. 436, 272-276 (2005).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323, 1747-1750 (2009).
- Keng, V. W., et al. A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma. Nature. 27, 264-274 (2009).
- Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature. 436, 221-226 (2005).
