Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren
Summary
Hochauflösung Röntgenstrahl-Computertomographie (HRCT) ist eine nicht-destruktive diagnostischen Bildgebungsverfahren, verwendet, um die Struktur und Funktion der Anlage Gefäßsystem in 3D studieren kann. Wir zeigen, wie HRCT ermöglicht Erforschung der Xylem Netzwerke über eine breite Palette von pflanzlichen Geweben und Arten.
Abstract
Hochauflösende Röntgen-Computertomographie (HRCT) ist eine nicht-destruktive diagnostischen Bildgebung mit sub-Mikrometer-Auflösungsvermögen, die jetzt verwendet wird, um die Struktur und Funktion pflanzlicher Xylem Netzwerk in drei Dimensionen (3D) zu bewerten (z. B. Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a, b). HRCT Imaging basiert auf den gleichen Prinzipien wie medizinische CT-Systeme, sondern auch eine hohe Intensität Synchrotron Röntgenquelle führt zu einer höheren räumlichen Auflösung auf und sank Bildaufnahmezeit. Hier zeigen wir im Detail, wie Synchrotron-HRCT (durchgeführt an der Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in Kombination mit Avizo Software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) verwendet wird, um Pflanzen Xylem zu erforschen, herausgeschnittene Gewebe und lebenden Pflanzen. Diese neue Imaging-Tool ermöglicht es Benutzern, über die traditionellen statischen 2D-Licht oder Elektronenstrahlen Aufnahmen und Studium Proben mittels virtueller serieller Schnitte in jeder Ebene zu bewegen. Eine unendliche Anzahl von Scheiben in jeder Orientierung ceine an der gleichen Probe, ein Feature, das physisch unmöglich ist mit herkömmlichen Mikroskopie-Methoden hergestellt werden.
Die Ergebnisse zeigen, dass HRCT sowohl krautige und holzige Pflanzen, und eine Reihe von Pflanzenteilen (dh Blätter, Blattstiele, Stängel, Stämme, Wurzeln) angewendet werden können. Hier präsentierten Zahlen dazu beitragen, sowohl eine Reihe von repräsentativen Anlage Gefäßanatomie und die Art der Ausschnitt aus HRCT Datensätzen, einschließlich Scans für Küstenmammutbaum (Sequoia sempervirens), Walnuss (Juglans spp.), Eiche (Quercus spp.) Und Ahorn extrahiert ( Acer spp.) Baumverjüngung die Sonnenblumen (Helianthus annuus), Weinreben (Vitis spp.) und Farnen (Pteridium aquilinum und Woodwardia fimbriata). Herausgeschnitten und getrocknet Proben von Gehölzen sind am einfachsten zu scannen und liefern typischerweise die besten Bilder. Allerdings haben die jüngsten Verbesserungen (dh schnellere Scans und Probenstabilisierung) machte es möglIVK diese Visualisierungstechnik auf grünem Gewebe (zB Blattstiele) und lebende Pflanzen verwenden. Anlässlich gewisse Schrumpfung des hydratisierten grünen Pflanzengewebe verursachen Bilder verschwimmen und Methoden zur Vermeidung dieser Probleme beschrieben werden. Diese jüngsten Fortschritte mit HRCT bieten vielversprechende neue Einblicke in Werk vaskuläre Funktion.
Introduction
Ein Netzwerk von miteinander verbundenen Leitungen, Fasern und Wohnen, metabolisch aktiven Zellen – Wasser wird aus pflanzlichen Wurzeln bis zu den Blättern in einer vaskulären Gewebe genannt Xylem transportiert. Transportfunktion pflanzlichen Xylem muß beibehalten werden, um Nährstoffe und Wasser, um Blätter für die Photosynthese, Wachstum, Überleben und letztlich zu liefern. Wassertransport in Xylem Leitungen können unterbrochen, wenn das Xylem Netzwerk durch pathogene Organismen beeinträchtigt wird. In Reaktion auf eine solche Infektionen Pflanzen produzieren häufig Gele, Zahnfleisch und Tylosen als Mittel zur Pathogenverbreitung Isolat (z. B. McElrone et al 2008; 2010). Trockenstress können auch einschränken, Wassertransport in Xylem. Wie Pflanzen Wasser verlieren bei längerer Trockenheit, baut Spannung in den Xylemsaft. Wasser unter Spannung metastabil ist (dh an einer bestimmten Schwelle die Spannung groß genug ist, wird Wasser Spalten in Xylem Leitungen enthaltenen kavitieren). Nach Kavitation auftritt, kann eine Gasblase (Embolie) bilden und füllen Sie die conduit, effektiv blockieren Bewegung des Wassers (Tyree und Sperry 1989), ein Phänomen, das analog zu Dekompressionskrankheit (dh "die Kurven") in Tiefseetaucher.
Trotz der Bedeutung der Xylem Wassertransport für optimales Pflanzenwachstum Funktion als von einem riesigen Körper der historischen und zeitgenössischen Literatur zu diesem Thema (Tyree & Zimmermann, 2002.; Holbrook et al, 2005) gezeigt hat, gibt es immer noch Aspekte der Xylem Netzwerke, die noch nicht greifbar . Mehrere Arbeitsgruppen haben vor kurzem damit begonnen mit Hilfe von High Resolution Röntgen-Computertomografie Mikro-Tomographie (HRCT), um feinere Details Holzanatomie und vaskulären Gewebe (z. B. Mayo et al bewerten; 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda und Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT ist eine zerstörungsfreie Technik verwendet, um Merkmale in dem Inneren von festen Objekten visualisieren und um digitale Informationen über ihre 3-D-strukturellen Eigenschaften zu erhalten. HRCTunterscheidet sich von herkömmlichen medizinischen CAT-Abtastung in seiner Fähigkeit, Informationen so klein wie ein Mikrometer Größe lösen, selbst für Objekte hoher Dichte. Jüngste Fortschritte in der Technologie haben Synchrotron HRCT Bildauflösung und Signal-Rausch-Verhältnis verbessert, so dass ausreichend Pflanze Gefäß Netzwerke und Gefäßtüpfeln Verbindungen visualisiert werden kann, zugeordnet 3D Koordinaten und exportiert für hydraulische Modellsimulationen. Brodersen et al. (2011) kürzlich erweiterte diese Technik durch die Kombination von 3D-Rekonstruktionen von Synchrotronstrahlung HRCT mit einem Fortran-Modell wird automatisch extrahiert Daten aus dem Xylem Netzwerk wesentlich höhere Auflösung als jemals mit traditionellen anatomischen Methoden (zB serielle Schnitte mit einem Mikrotom möglich erzeugt und Bilderfassung mit Lichtmikroskopie, z. B. Zimmermann 1971). Diese Arbeit wurde auch verwendet, um Hydraulik-Modelle des Systems zu optimieren und Xylem identifizierten einzigartigen Eigenschaften des Verkehrs (dh in gewisser Rücklauf vessels in Spitzenzeiten Transpiration) (Lee et al., in review).
Synchrotron HRCT kann nun verwendet werden, um Xylem Funktionalität, die Anfälligkeit für Kavitation, und ein Pflanzen die Fähigkeit, die embolisiert Leitungen reparieren zu visualisieren. Failure wieder herzustellen Strömung in embolisiert Leitungen reduziert hydraulische Kapazität, Grenzen Photosynthese, und die Ergebnisse in Absterben der Pflanze im Extremfall (McDowell et al. 2008). Pflanzen können mit Embolien durch die Umleitung Wasser um Blockaden über Gruben, die benachbarte funktionelle Leitungen und durch die wachsende neue Xylem verloren hydraulische Kapazität ersetzen bewältigen. Einige Pflanzen besitzen die Fähigkeit, Brüche in der Wassersäule zu reparieren, aber die Details dieses Prozesses im Xylem unter Spannung geblieben unklar Jahrzehnten. Brodersen et al. (2010) kürzlich visualisiert und quantifiziert die Nachfüllen im Live-Reben mit HRCT. Erfolgreiche Schiffes Nachfüllen war abhängig von Wasserzutritt aus lebenden Zellen rund um die xylem Leitungen, wo einzelne Wassertropfen im Laufe der Zeit erweitert, gefüllten Gefäße, und zwang die Auflösung des eingeschlossenen Gases. Die Kapazität der verschiedenen Pflanzen kompromittiert Xylemgefäße und die Mechanismen, die diese Reparaturen repariert werden derzeit untersucht.
Beschreibung der ALS Anlage Beamline 8.3.2
Unsere bisherigen Arbeiten auf dem Hard X-ray Micro-Tomographie Beamline 8.3.2 wurden an der Advanced Light Source in Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA) durchgeführt. Pflanze Proben werden in einem verbleiten hutch sich 20 m von der Röntgenquelle, durch einen 6 Tesla supraleitenden Magneten Dipol Biegung innerhalb der Advanced Light Source Elektronenspeicherring der bei einer kritischen Energie von 11,5 KeV erzeugt platziert. Eine schematische Darstellung des Endstations ist in Abbildung 1 gezeigt. Die Röntgenstrahlen geben den Stall mit einem Strahl Größe 40x ~ 4,6 mm und durch die Probe, die auf einem motorisierten Drehtisch montiert ist. Dieübertragenen Röntgenstrahlen auf einen Kristall Szintillator (zwei Materialien häufigsten verwendeten sind LuAG oder CdWO 4), die Röntgenstrahlen in sichtbares Licht, das über Linsen auf eine CCD für Bildsammelvorrichtung weitergeleitet wird umzuwandeln auftreffen. Die Kamera, Szintillator und Optik in einer lichtdichten Box, die auf Schienen, die die Probe-zu-Szintillator Entfernung um Phasenkontrast-Abbildung optimiert werden kann ist enthalten.
Alle Proben werden nach dem 10 cm Durchmesser Drehtisch, der wiederum auf horizontale und vertikale Translation Stufen zur Positionierung der Probe angebracht ist. Eine lebende Pflanze Probe, mit der Wurzel in einem speziell angefertigten Blumentopf Halter und das Laub in einer Acryl-Röhre enthaltenen montiert ist, kann in Abbildung 2 zu sehen. Typische Belichtungszeiten von 0,1 bis 1 sec mit 10-18 keV und Scan Dauern wird von 5-40 min je nach den Einstellungen für eine bestimmte Probe optimiert reichen. Für große Proben (typisch pflanzlichen Xylem Netze) können Daten-Scans werdengefliesten durch Wiederholung der Messung an der Probe in unterschiedlichen Höhen, die automatisch gesteuert wird, so dass nahtlose serielle Schnitte entlang einer maximalen Probenhöhe von ~ 10 cm. Maximale Probenbreite bei der Bildgebung bei 4,5 mm Auflösung ~ 1 cm für Proben, die nahezu perfekt in vertikaler Ausrichtung sind, ist. Datengenerierung und-Verarbeitung abgeschlossen ist mit dem Protokoll aufgelistet. Wegen des Unterschiedes in der Röntgen-Dämpfung zwischen Luft und Wasser, kann ausgezeichnete Bildkontrast in Pflanzen ohne den Einsatz von Kontrastmitteln, die typisch für medizinische CT-Systeme erhalten werden. Die luftgefüllten Gefäßlumen ist leicht von dem umgebenden Wasser gefüllten Gewebes in hydratisierter Pflanzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synchotron HRCT bietet Pflanzenbiologen mit einem starken, nicht-destruktive Werkzeug, um das Innenleben der Anlage Gefäßsystem in unglaublichen Details zu erforschen. Diese Konnektivität drastisch verändern kann die Fähigkeit der vaskulären Krankheitserreger und Embolien zu verbreiten – Diese Technologie wurde vor kurzem um bisher nicht beschriebene anatomischen Strukturen in grapevine Xylem, die unterschiedlich verändern Xylem Netzwerkverbindung in verschiedenen Weinspezies (. Brodersen et al …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei S Castorani, AJ Eustis, GA Gambetta, CM Manuck, Z Nasafi und A Zedan danken. Diese Arbeit wurde gefördert durch: das US Department of Agriculture-Agricultural Research Service Current Research Information System Finanzierung (Forschungsprojekt Nr. 5306-21220-004-00; Der Advanced Light Source wird von dem Direktor, Office of Science, Office of Basic unterstützt. Energy Sciences des US Department of Energy unter Vertrag Nr. DE-AC02-05CH11231);. und NIFA Sonderkulturen Forschungsinitiative Zuschuss zu AJM.
Materials
| Material Name/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2 |
References
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