El uso de alta resolución de tomografía computarizada para visualizar la estructura tridimensional y la función de la Planta Vasculatura

Summary

Alta resolución de rayos X de tomografía computarizada (HRCT) es una técnica no destructiva de imágenes diagnósticas que se pueden utilizar para estudiar la estructura y función de la vasculatura planta en 3D. Se demuestra cómo HRCT facilita la exploración de redes de xilema a través de una amplia gama de tejidos y especies vegetales.

Abstract

Alta resolución de rayos X de tomografía computarizada (HRCT) es una técnica no destructiva de diagnóstico por imagen con capacidad de resolución inferior a la micra que se utiliza actualmente para evaluar la estructura y la función de red de la planta xilema en tres dimensiones (3D) (por ejemplo Brodersen et al . 2010; 2011; 2012A, b). HRCT formación de imágenes se basa en los mismos principios que los sistemas de TC médica, pero una alta intensidad de sincrotrón de rayos X Fuente de los resultados en una mayor resolución espacial y menor tiempo de adquisición de imagen. Este sentido, demuestran con detalle cómo sincrotrón basada TCAR (realizada en el Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, EE.UU.) en combinación con Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, EE.UU.) se está utilizando para explorar xilema en plantas extirpados tejidos y plantas vivas. Esta nueva herramienta de imagen permite a los usuarios ir más allá del tradicional luz estática, 2D o micrografías electrónicas de estudio y muestras virtuales utilizando las secciones de serie en cualquier plano. Un número infinito de segmentos en cualquier c orientaciónun hacerse en la misma muestra, una característica que es físicamente imposible con los métodos tradicionales de microscopía.

Los resultados demuestran que HRCT puede ser aplicado tanto a especies herbáceas y leñosas de las plantas, y una serie de órganos de la planta (es decir, hojas, peciolos, tallos, troncos, raíces). Las cifras presentadas aquí ayudar a demostrar tanto una gama de anatomía vascular representante planta y el tipo de detalles extraídos de bases de datos, incluyendo HRCT exploraciones de secoya (Sequoia sempervirens), nogal (Juglans spp.), Roble (Quercus spp.) Y arce ( Acer spp.) árboles jóvenes a girasol (Helianthus annuus), vid (Vitis spp.) y helechos (Pteridium aquilinum y fimbriata Woodwardia). Muestras extirpados y secado de especies leñosas son más fáciles de detectar y suelen producir las mejores imágenes. Sin embargo, las mejoras recientes (es decir, las exploraciones más rápidas y la estabilización de la muestra) han hecho possible para utilizar esta técnica de visualización en los tejidos verdes (por ejemplo, pecíolos) y en plantas vivas. De vez en cuando un poco de encogimiento de los tejidos vegetales verdes hidratados causará que las imágenes borrosas y los métodos para evitar estos problemas se describen. Estos avances recientes con HRCT proporcionar prometedores nuevos conocimientos sobre la función de la planta vascular.

Introduction

El agua es transportada desde las raíces de las plantas a las hojas en un tejido vascular llamado xilema – una red de conductos interconectados, fibras, y las células vivas, metabólicamente activas. Función Transporte de xilema planta se debe mantener para suministrar nutrientes y agua a las hojas para la fotosíntesis, crecimiento y supervivencia en última instancia. Transporte por agua en los conductos del xilema puede ser interrumpido cuando la red xilema se ve comprometida por organismos patógenos. En respuesta a las plantas tales infecciones a menudo producen geles, gomas, y tilosas como un medio para aislar la diseminación de patógenos (por ejemplo McElrone et al 2008; 2010). La sequía también puede limitar el transporte de agua en el xilema. Mientras que las plantas pierden agua durante una sequía prolongada, la tensión se acumula en la savia del xilema. Agua bajo tensión es metaestable (es decir, en un determinado umbral de la tensión aumenta lo suficiente como para cavitar columnas de agua contenidas en los conductos del xilema). Después de la cavitación se produce una burbuja de gas (embolia) pueden formar y llenar las conduit, bloqueando efectivamente el movimiento del agua (Tyree y Sperry, 1989), un fenómeno análogo a la enfermedad de descompresión (es decir, "the bends") en buzos de aguas profundas.

A pesar de la importancia del transporte por el xilema el agua para la función óptima de la planta, como lo demuestra un vasto cuerpo de literatura histórica y contemporánea sobre el tema (Tyree y Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), todavía hay aspectos de las redes de xilema que sigue siendo difícil . Varios grupos de investigación han comenzado a utilizar recientemente alta resolución radiografía computarizada micro-tomografía computarizada (HRCT) para evaluar los detalles más finos de la anatomía de la madera y el tejido vascular (por ejemplo Mayo et al; 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012A, b; Maeda y Miyake, 2009; Estepa et al 2004).. HRCT es una técnica no destructiva utiliza para visualizar características en el interior de cuerpos sólidos y para obtener información digital en 3-D de sus propiedades estructurales. TCARdifiere del médico convencional CAT-exploración en su capacidad para resolver detalles tan pequeños como una micra de tamaño, incluso para objetos de alta densidad. Los recientes avances en la tecnología de sincrotrón HRCT han mejorado resolución de imagen y de señal a ruido suficiente para que redes de planta de los vasos y las conexiones intervasculares puede ser visualizado, asigna coordenadas 3D, y se exportan para simulaciones de modelos hidráulicos. Brodersen et al. (2011) recientemente avanzó esta técnica mediante la combinación de reconstrucciones 3D generados por sincrotrón HRCT con un modelo de Fortran que extrae automáticamente los datos de la red de xilema una resolución mucho más alta que nunca fue posible con los métodos tradicionales de serie anatómicas (es decir, corte con un microtomo y captura de imágenes con microscopía de luz, por ejemplo Zimmermann 1971). Este trabajo también ha sido utilizado para optimizar los modelos hidráulicos del sistema de xilema y se identificaron las características únicas de transporte (es decir, flujo inverso en algunos hessels durante los períodos de transpiración pico) (Lee et al., en revisión).

Sincrotrón HRCT ahora se puede utilizar para visualizar la funcionalidad de xilema, la susceptibilidad a la cavitación, y la capacidad de las plantas para reparar conductos embolizados. La imposibilidad de re-establecer el flujo en conductos embolizados reduce la capacidad hidráulica, la fotosíntesis límites, y resulta en muerte de la planta en casos extremos (McDowell et al. 2008). Las plantas pueden hacer frente a embolias mediante el desvío de agua alrededor de las obstrucciones a través de pozos de conexión adyacentes conductos funcionales, y por la creciente xilema nueva para reemplazar la capacidad perdida hidráulica. Algunas plantas tienen la capacidad de reparar roturas en las columnas de agua, pero los detalles de este proceso en el xilema bajo tensión se ha mantenido claro por décadas. Brodersen et al. (2010) recientemente visualizar y cuantificar el proceso de recarga en vid en directo mediante TCAR. Recipiente de rellenado éxito depende de afluencia de agua de las células vivas que rodea el xylem conductos, donde las gotas de agua individuales se expandieron a través del tiempo, los vasos llenos, y obligó a la disolución del gas atrapado. La capacidad de las diferentes plantas para reparar comprometidos vasos del xilema y de los mecanismos que controlan estas reparaciones están siendo investigados.

Descripción de la instalación de la línea de luz ALS 8.3.2

Nuestro trabajo hasta la fecha ha llevado a cabo en el Hard X-ray Micro-Tomografía línea de luz 8.3.2 en la Fuente Avanzada de Luz en el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley (Berkeley CA, EE.UU.). Las muestras de plantas se colocan en un forrado de plomo conejera situado a 20 m de la fuente de rayos X, generado por un imán superconductor 6 Tesla curva dipolo dentro de la Fuente Avanzada de Luz operativo anillo de electrones almacenamiento a una energía crítica de 11,5 KeV. Un esquema de la estación final se muestra en la figura 1. Los rayos X de entrar en la cabina con un tamaño de haz de 40x ~ 4,6 mm y pasar a través de la muestra que está montado en una etapa giratoria motorizada. Latransmitida rayos X inciden en un contador de centelleo de cristal (dos materiales normalmente utilizados son LuAG o CdWO ₄₎ que convertir los rayos X en luz visible que se transmite a través de las lentes en un CCD para la recogida de imagen. La cámara, centelleador y la óptica están contenidos en una caja de luz que es apretado sobre raíles que permite que la distancia de muestra a centelleador para ser optimizado para formación de imágenes de contraste de fase.

Todas las muestras se montan en la etapa 10 cm de diámetro giratorio que a su vez está montado en etapas traslación horizontal y vertical para la colocación de la muestra. Una muestra de la planta de té, con el sistema de la raíz montado en un soporte personalizado construido maceta y el follaje contenida en un tubo de acrílico, se puede ver en la Figura 2. Los tiempos típicos de exposición puede variar desde 0,1 hasta 1 seg usando 10-18 KeV, y duraciones de exploración variará 5 a 40 min dependiendo de los ajustes optimizados para una muestra particular. Para las muestras de altura (típico de las redes de xilema de la planta), exploraciones de datos puede serbaldosas repitiendo la medición con la muestra a diferentes alturas, que se controla automáticamente, permitiendo sin costura de serie de secciones a lo largo de una altura de muestra máxima de ~ 10 cm. Anchura máxima de la muestra cuando la imagen a una resolución de 4,5 m es de ~ 1 cm para las muestras que son casi perfecta en orientación vertical. Generación y procesamiento de datos se completa usando el protocolo enumeran a continuación. Debido a la diferencia en la atenuación de los rayos x entre el aire y el agua, excelente contraste de imagen se puede conseguir en las plantas sin el uso de soluciones de contraste típico de los sistemas médicos de CT. La luz del vaso lleno de aire es fácilmente distinguible de la circundante llena de agua del tejido en las plantas hidratadas.

Protocol

Detalles del protocolo descrito a continuación fueron escritos específicamente para el trabajo en la Fuente Avanzada de Luz 8.3.2 línea de luz. Las adaptaciones pueden ser necesarios para el trabajo en otras instalaciones de sincrotrón. Seguridad y capacitación adecuadas radiación es necesaria para el uso de estas instalaciones. 1. Preparación de muestras de las plantas vivas Crecer las plantas en macetas de ~ 10 cm de diámetro, y asegurar que el tallo principal (o porció…

Representative Results

Synchotron TACAR han aplicado con éxito en una amplia variedad de tejidos y especies vegetales utilizando la línea de luz 8.3.2 (Figura 5), y han proporcionado nuevos conocimientos sobre la estructura y función del xilema en planta de resolución sin precedentes en 3D. Las capacidades de visualización y exploración proporcionados por las reconstrucciones en 3D (como se ilustra en las Figuras 6-8, y 1-3) Películas para permitir la determinación precisa de la ubicación y orientaci…

Discussion

Synchotron TCAR proporciona biólogos de plantas con una potente herramienta no destructiva para explorar el funcionamiento interno del sistema vascular de plantas con un detalle increíble. Esta tecnología se ha utilizado recientemente para identificar las estructuras anatómicas no descritas previamente en el xilema vid diferencialmente que alteran la conectividad de red xilema en diferentes especies de vid (Brodersen et al 2012b, en prensa.) – Esta conectividad puede alterar drásticamente la capac…

Materials

Material Name/Equipment	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
			See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2