2-tillukning af blodkar / Hypotension: A Rat Model of Global hjerneiskæmi

Summary

Bilateral carotis okklusion kombineret med systemisk hypotension producerer global hjerneiskæmi i rotter, hvilket resulterer i skader på hippocampus med reproducerbare sværhedsgrad. Animal fag er svækket med forudsigelige mønstre af hjerneskade, de kommer sig hensigtsmæssigt, og dødeligheden er forholdsvis lav.

Abstract

Hjertestop efterfulgt af genoplivning ofte resulterer i en dramatisk hjerneskade forårsaget af iskæmi og efterfølgende reperfusion af hjernen. Globale hjerneiskæmi producerer skade på bestemte områder af hjernen har vist sig at være meget følsomme over for iskæmi ^1. Hippocampale neuroner har højere følsomhed til iskæmiske fornærmelser forhold til andre cellepopulationer, og specifikt, CA1-regionen af hippocampus er særligt udsatte for iskæmi / reperfusion ^2.

Udformningen af ​​terapeutiske interventioner, og til undersøgelse af mekanismer involveret i cerebral skade, kræver en model, der producerer lignende skader den kliniske tilstand og på en reproducerbar måde. Bilateral carotis tillukning af blodkar med hypotension (2VOH) er en model, der producerer reversibel forhjerneiskæmi, efterligne cerebrale begivenheder, der kan opstå under hjertestop og genoplivning. Vi beskriver en model modificeret fra Smith et al. (1984) ², Som første gang præsenteret i sin nuværende form i Sanderson et al. (2008) ^3, der producerer reproducerbar skade selektivt sårbare områder af hjernen ^3-6. Pålideligheden af ​​denne model er dikteret af præcis styring af systemiske blodtryk under anvendt hypotension, varigheden af ​​iskæmi tæt temperaturkontrol, en specifik anæstesi regime, og omhyggelig postoperativ pleje. 8 minutter iskæmiske skade producerer celledød af CA1 hippocampale neuroner, der skrider i løbet af 6 til 24 timer af reperfusion, mens mindre sårbare hjerneregioner skånet. Denne progressiv celledød nemt kvantificeres efter 7-14 dage reperfusion, som et næsten komplet tab af CA1 neuroner er tydeligt på dette tidspunkt.

Ud over denne hjerneskade model præsenterer vi en metode til CA1 skade kvantificering hjælp af en simpel, men grundig, metodologi. Vigtigere, kan kvantificering opnås ved anvendelse af en simpel kameramonteret mikroskop, enda fri ImageJ (NIH) software-plugin, der ikke er behov for omkostningseffektive uoverkommelige stereologi softwareprogrammer og et motoriseret mikroskopisk scene for skadesvurdering.

Introduction

Hjerneskade som følge af hjertestop og slagtilfælde er en førende årsag til død og langvarig invaliditet. Mens genoplivningsudstyr til ofre for hjertestop lykkes at genoprette spontan cirkulation i omkring 70.000 patienter om året i USA ^7,8 mindst 60% af disse patienter efterfølgende dør på hospitalet som følge af en omfattende hjerneskade og kun 3-10% af genoplivet patienterne kan genoptage deres tidligere livsstil ^9,10. Det er klart, at forstå de mekanismer, der fører til hjerneskade efter global hjerneiskæmi og designe terapeutiske indgreb for at minimere neurologiske traumer er af afgørende betydning.

Hjerneiskæmi kan modelleres udnytte flere metoder. Mest almindeligt er hjerneiskæmi produceret i gnaver ved okkludere et større blodkar i hjernen, den midterste cerebrale arterie, hvilket frembringer en fokal iskæmisk slagtilfælde ^11,12. Mens klinisk vigtig,fokal hjerneiskæmi er ikke en præcis metode til at studere hjerneskade fremstillet ved hjertestop / genoplivning. At modellere denne kliniske paradigme hele hjernen skal gøres iskæmisk efterfulgt af genindførelse af blodgennemstrømningen. Til nøje at efterligne denne kliniske præsentation, efterforskere eksperimentelt fremkalde hjertestop efterfulgt af genoplivning med hjertemassage og defibrillering ^13,14. Denne model er klinisk relevant, kan dog uforudsigelige genoplivning tider øger variabilitet og kan gøre dataanalyse vanskeligt at fortolke. Derudover er denne model forbundet med en høj dødelighed, hvilket yderligere øger dyrenummer nødvendigt at teste en hypotese. Undersøgelse af cerebral reaktion på global iskæmi og / eller reperfusion i en mere reproducerbar, sammenhængende og levedygtige fornærmelse kan foretrækkes.

Global iskæmi kan induceres i hjernen og samtidig bevare nogle blodgennemstrømningen systemisk. Dette reducerer dødelighed, samtidig med at investigation af mekanismerne i vævsskade i hjernen ^2.. At producere globale hjerneiskæmi, er det nødvendigt at afbryde eller i høj grad begrænse strømning i alle fire blodkar, som forsyner hjernen, de interne halspulsårer og vertebrale arterier. Disse skibe forsyne hjernen med blod flow gennem en vaskulær struktur kaldet Circle of Willis, som udgør en anastomotisk løkke. Denne vaskulære arkitektur tillader hjernen at fastholde perfusion i tilfælde af proximale vaskulær okklusion. Derfor skal til at inducere fuldstændig iskæmi af hjernen blodgennemstrømning gennem alle bidragende fartøjer forekomme. Halspulsåren okklusion kan opnås ved hjælp af en minimalt invasiv ventrale hals cut-ned og anvendelse af aneurisme klip for en ønsket periode. Afbrydelse af blodgennemstrømningen via vertebrale arterier kan være vanskelig, da de er incased i tværgående huller af rygsøjlen. Efterforskere har behandlet dette ved at electrocauterizing vertebrale arterier 24-48 hr før carotisokklusion og hjerneiskæmi (4VO model) ^15. I modsætning til denne fremgangsmåde, udviklede Smith et al. En fremgangsmåde til induktion af globale hjerneiskæmi ved at reducere betyde arterielt blodtryk (MAP) systemisk til 40 mmHg at reducere perfusion gennem de vertebrale arterier til et punkt, hvor blodgennemstrømningen er tabt eller reduceres kraftigt ² . Når kombineret med carotis okklusion, denne metode giver iskæmi hele forhjernen, hvilket resulterer i et mønster af hjerneskade, der nøje efterligner hjertestop overlevende. I en yderligere forfining af denne metode kræver den model, vi præsenterer her tight MAP regulering på 30 mmHg ± 1mHg under hele 8 min af iskæmi. Vi fandt dette ændring forbedrer reproducerbarheden af hjerneskade induceret af denne model og samtidig bevare den lave dødelighed af den oprindelige teknik designet af Smith et al.

Den præcise fænotype celledød og samlede omfang af vævsskader forårsaget afden model, der præsenteres her er direkte afhængige af iskæmisk varighed ^16. Efter 8 min iskæmi, udviser CA1 neuroner forsinket celledød, hvilket antyder, at der er en tidsmæssig vindue til terapeutisk intervention i reperfusionsfasen ^15,17. Ved starten af reperfusion hurtigt neuroner genvinde funktion og ikke umiddelbart celledød er påviseligt ^18.. Men dette fornærmelse forårsager induktion af celledød kaskader (apoptose), der kulminerer med frigivelsen af apoptogenic proteiner fra mitokondrier, herunder cytochrom c, mellem 4-6 hr reperfusion ^3,19. Mellem 6 og 24 timers reperfusion, har neuroner i CA1 hippocampus forpligtet til celle død, og den apoptotiske celledød program gennemføres ^19.. Det skal bemærkes, at celledød fænotype ansvarlig for iskæmisk skade er yderst kontroversiel. Tidlige undersøgelser har antydet nekrose er den primære celledød fænotype ^20,21, mens andre andre rapporterer apoptOSIS som den vigtigste mekanisme ^22,23. I alt tyder aktuelle beviser for, at cellerne dør af et spektrum af celledød fænotyper spænder fra klassisk apoptose til nekrose. Den specifikke form for celledød er afhængig af mange faktorer, med graden af bidragene fra hver fænotype afhængigt af sværhedsgraden af den fornærmelse, blandt andre faktorer ^24,25. Ved 24 timers reperfusion, besidder døende celler pyknotiske kerner, kondenseret cytosol med klare beviser for aggregerede cellulære indhold og tab af funktionel mitokondrie morfologi. Døde celler er yderligere opdelt, opslugt af immunceller såsom makrofager og / eller mikroglia og slettes fra CA1 hippocampus region. Ved 4-7 dage reperfusion er døde celler fjernes, og alle, der er tilbage er inflammatoriske celler og aktiverede gliaceller ^17,26. Derfor 7 dages reperfusion repræsenterer en optimal tid, hvor CA1 hippocampus neuronal død kan kvantificeres ved hjælp af enkle, uspecifikke celle pletterinklusive cresylviolet eller hemotoxylin-eosin og tælles baseret på morfologiske inklusionskriterier. Celler forbliver på dette sene reperfusion interval kan regnes som overlevende celler, hvilket giver et indeks for hjerneskade.

Hvis denne model er at blive udnyttet til at teste terapeutiske indgreb, foreslås det, at den eksperimentelle design følge TRAPPE kriterier (Stroke Terapi Academic Industri Roundtable) ^27. Disse retningslinjer bør følges ved udformning og gennemførelse af en undersøgelse, der dog ikke behandles her.

Protocol

1.. Forberedelse Alle dyreforsøg skal overholde de institutionelle retningslinjer og modtage godkendelse fra en respektiv dyrepleje udvalg forud for indledningen. Alle procedurer, der præsenteres her er blevet godkendt af Wayne State University Institutional Animal Care og brug Udvalg og følge de retningslinjer for etisk behandling af dyr, som rakte i Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr, og den amerikanske regering principper for Udnyttelse og pleje af hvirveldyr, der anvendes i te…

Representative Results

Den 2VOH model af global hjerne iskæmi / reperfusion forårsager neuronal død i CA1-regionen af hippocampus. Figur 2 repræsenterer den skade produceret af 8 min på globale hjerneiskæmi, forarbejdet 14 dage efter reperfusion. 2A og 2B sammenligne hippocampusen fra fingeret og post-iskæmiske hjerner, farvet med cresylviolet. 2A viser en hippocampus fra en skinopereret rotte, som udviser normal morfologi, herunder en intakt CA1. Figur 2B</str…

Discussion

Den her beskrevne model giver en iskæmisk fornærmelse til hjernen, der kan opstå som følge af hjertestop og genoplivning, giver en skade svarende til den, der findes hos mennesker. Denne fremgangsmåde til fremstilling af den globale hjerneiskæmi er en af ​​flere protokoller. Vi bruger denne protokol fremmest for sin forholdsvis lav dødelighed, hurtig genopretning og reproducerbare resultater. Den hjertestop / genoplivning model er velsagtens den mest klinisk relevant model, men teknisk set den mest vanskelige…

Materials

			Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
			Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
			Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
			Software
ImageJ	NIH