2-oclusão do vaso / hipotensão: um modelo de rato de isquemia cerebral

Summary

Oclusão carotídea bilateral juntamente com hipotensão sistêmica produz isquemia cerebral em ratos, resultando em danos ao hipocampo com gravidade reproduzível. Assuntos animais são prejudicados com padrões previsíveis de danos cerebrais, eles se recuperam expediente, e as taxas de mortalidade são comparativamente baixas.

Abstract

Parada cardíaca seguido de reposição muitas vezes resulta em danos cerebrais dramática causada por isquemia e reperfusão posterior do cérebro. Isquemia cerebral global produz dano para regiões específicas do cérebro revelaram estar altamente sensíveis à isquemia ^1. Neurónios do hipocampo têm maior sensibilidade a insultos isquémicos em comparação a outras populações de células, e, especificamente, na região CA1 do hipocampo, é particularmente vulnerável a lesão de isquemia / reperfusão ^2.

O desenho das intervenções terapêuticas, ou estudo dos mecanismos envolvidos nos danos cerebrais, exige um modelo que produz danos similares aos do estado clínico e de uma forma reproduzível. Oclusão do vaso carótida bilateral com hipotensão (2VOH) é um modelo que produz isquemia do prosencéfalo reversível, emulando os eventos cerebrais que podem ocorrer durante a parada cardíaca e ressuscitação. Descrevemos aqui um modelo modificado de Smith et ai. (1984) ², Como apresentado pela primeira vez em sua forma atual em Sanderson et al. (2008) ^3, que gera lesão reprodutível para seletivamente regiões cerebrais vulneráveis ^​​3-6. A confiabilidade deste modelo é ditada pelo controle preciso da pressão arterial sistêmica durante hipotensão aplicada, o tempo de isquemia, controle de temperatura perto, um regime de anestesia específico, e diligente cuidados pós-operatórios. Um insulto isquémico 8 minutos produz a morte celular dos neurónios CA1 do hipocampo, que progride ao longo de 6 a 24 horas de reperfusão, enquanto que as regiões do cérebro menos vulneráveis ​​são poupados. Esta morte celular progressiva é facilmente quantificada após 7-14 dias após reperfusão, com uma perda quase total de neurónios CA1 é evidente nesta altura.

Em adição a este modelo de lesão cerebral, apresentamos um método para quantificação de dano CA1 usando um método simples, mas completa, a metodologia. Importante, a quantificação pode ser realizada utilizando um microscópio de câmara simples montado, umada livre ImageJ (NIH) plug-in de software, eliminando a necessidade de programas de software estereologia custo proibitivo e um palco motorizado microscópica para avaliação dos danos.

Introduction

Dano cerebral em conseqüência de parada cardíaca e acidente vascular cerebral é a principal causa de morte e incapacidade a longo prazo. Enquanto ressuscitação cardiopulmonar para vítimas de parada cardíaca consegue restaurar a circulação espontânea em cerca de 70 mil pacientes por ano em os EUA ^7,8 pelo menos 60% desses pacientes morrem posteriormente no hospital, como resultado de extensa lesão cerebral e apenas 3-10% dos pacientes reanimados pode retomar seus antigos estilos de vida ^9,10. Claramente, a compreensão dos mecanismos que levam a danos cerebrais após isquemia cerebral global e planejamento de intervenções terapêuticas para minimizar o trauma neurológico é de importância crítica.

A isquemia cerebral pode ser modelado utilizando vários métodos. Mais vulgarmente, a isquemia cerebral é produzida no roedor, ocluindo um grande vaso sanguíneo no cérebro, a artéria cerebral média, produzindo, assim, um acidente vascular cerebral isquémico focal ^11,12. Embora clinicamente importante,isquemia cerebral focal não é um método preciso para estudar danos cerebrais produzidos pela prisão / reanimação cardíaca. Para modelar este paradigma clínico todo o cérebro deve ser feita isquêmica seguido de reintrodução do fluxo sanguíneo. Para imitar de perto esta apresentação clínica, os investigadores experimentalmente induzir parada cardíaca seguida de reanimação com CPR e desfibrilação ^13,14. Este modelo é clinicamente relevante, os tempos de ressuscitação entanto imprevisíveis podem aumentar a variabilidade e análise dos dados pode tornar difícil de interpretar. Além disso, este modelo está associado a uma taxa de mortalidade elevada, aumentando ainda mais o número necessário para testar uma hipótese animal. Investigação da resposta a isquemia cerebral global e / ou reperfusão num insulto mais reprodutível, consistente e sobrevivência podem ser preferidos.

Isquemia global pode ser induzida no cérebro enquanto preserva alguma circulação sanguínea sistémica. Isto reduz a mortalidade, enquanto permite Investigation dos mecanismos de danos nos tecidos no cérebro ^2. Para produzir a isquemia global do cérebro, que é necessário para interromper ou limitar o fluxo grandemente em todos os quatro vasos que alimentam o cérebro, as artérias carótida interna e artérias vertebrais. Estas embarcações abastecer o cérebro com o fluxo de sangue através de uma estrutura vascular chamado Círculo de Willis, que faz um loop anastomose. Esta arquitectura permite que o cérebro vascular para manter a perfusão no caso de oclusão vascular proximal. Portanto, para induzir isquemia completo do cérebro, o fluxo de sangue através dos vasos contributivo deve ocorrer. A oclusão da artéria carótida interna pode ser realizada utilizando um pescoço ventral minimamente invasivo de corte para baixo e de aplicação de clipes aneurisma durante um período desejado. A interrupção do fluxo de sangue através das artérias vertebrais, pode ser difícil, uma vez que são encaixada no forame transversal da coluna vertebral. Investigadores têm abordado este por electrocauterizing as artérias vertebrais 24-48 h antes da carótidaoclusão e isquemia cerebral (modelo 4VO) ^15. Em contraste com esta abordagem, Smith et ai. Desenvolveu um método de indução de isquemia cerebral global reduzindo a pressão arterial média (PAM) sistemicamente a 40 mmHg, para reduzir a perfusão através das artérias vertebrais, para um ponto onde o fluxo de sangue é perdido muito reduzida ou ^dois . Quando combinada com a oclusão da carótida, este método produz ao longo da isquemia do prosencéfalo, resultando num padrão de dano cerebral que imita o de sobreviventes de paragem cardíaca. Num outro aperfeiçoamento deste método, o modelo que aqui apresentamos requer regulação apertada MAP em 30 mmHg ± 1mHg durante toda a 8 minutos de isquemia. Encontramos esta alteração melhora a reprodutibilidade de dano cerebral induzido por este modelo, preservando a baixa taxa de mortalidade da técnica original desenhado por Smith et al.

O fenótipo precisa da morte celular e da extensão total do dano tecidual causado pelao modelo apresentado aqui são diretamente dependentes da duração isquêmica ^16. Após 8 minutos de isquemia, neurónios CA1 exibem retardada de morte celular, sugerindo que existe uma janela temporal para a intervenção terapêutica, durante a fase de reperfusão ^15,17. No início da reperfusão, os neurónios rapidamente recuperar a função de morte celular e não é detectável ¹⁸ imediato. No entanto, este insulto provoca indução de cascatas de morte celular (apoptose) que culminam na liberação de proteínas apoptogénica de mitocôndrias, incluindo o citocromo c, entre 4-6 horas de reperfusão ^3,19. Entre 6 e 24 horas de reperfusão, os neurônios CA1 do hipocampo se comprometeram a morte celular, eo programa de morte celular por apoptose é executado ^19. Deve notar-se que o fenótipo de morte celular responsável pela lesão isquémica é altamente controversa. Estudos anteriores sugeriram que a necrose é a morte celular primário fenótipo ^20,21, enquanto outros outros relatam apoptosis como o principal mecanismo ^22,23. No total, as evidências atuais sugerem que as células morrem de um espectro de fenótipos de morte celular que variam de apoptose clássico à necrose. O modo específico de morte de células está dependente de muitos factores, com o grau de contribuição de cada fenótipo dependendo da gravidade da lesão, entre outros factores ^24,25. Por 24 horas de reperfusão, as células morrem possuem núcleos picnóticos, citoplasma condensado com clara evidência de conteúdo celular agregados e perda de morfologia mitocondrial funcional. As células mortas são subdivididas, tragado por células do sistema imunológico, como os macrófagos e / ou micróglia e limpa da região CA1 do hipocampo. Por 4-7 dias de reperfusão, as células mortas são removidas, e tudo o que resta são as células inflamatórias e ativado células gliais ^17,26. Portanto, 7 dias de reperfusão representa um momento ideal CA1 do hipocampo, onde a morte neuronal pode ser quantificado usando, manchas de células não-específicos simples eminclusive violeta Cresyl ou hemotoxilina-eosina e contou com base em critérios de inclusão morfológicas. As células remanescentes no final deste intervalo de reperfusão pode ser contado como células sobreviventes, proporcionando assim um índice de danos cerebrais.

Se este modelo é para ser utilizado para testar intervenções terapêuticas, sugere-se que o projeto experimental seguir critérios Stair (Curso Terapia Indústria Acadêmico Roundtable) ^27. Essas diretrizes devem ser seguidas na concepção e realização de um estudo, no entanto, não são discutidos aqui.

Protocol

1. Preparação Todos os experimentos com animais devem estar em conformidade com as diretrizes institucionais e receber a aprovação por um respectivo comitê de cuidados com os animais antes do início. Todos os procedimentos aqui apresentados foram aprovados pela Wayne State University Institutional Animal Care e do Comitê Use e siga as orientações sobre o tratamento ético dos animais, como colocar diante do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aos Princípios do Gove…

Representative Results

O 2VOH modelo de isquemia cerebral global / reperfusão provoca a morte neuronal na região CA1 do hipocampo. Figura 2 representa a lesão produzida por 8 min de isquemia cerebral global, processada 14 dias após a reperfusão. Figuras 2A e 2B comparar os hipocampos de engodo e cérebros pós-isquêmica, corados com violeta Cresyl. figura 2A mostra um hipocampo de um rato sham-operado que apresenta morfologia normal, incluindo um CA1 intacta. fi…

Discussion

O modelo descrito aqui produz um insulto isquémico no cérebro que pode ocorrer como resultado de paragem cardíaca e ressuscitação, proporcionando uma lesão similar à encontrada nos seres humanos. Este método para a produção de isquemia cerebral global é um de vários protocolos. Nós utilizamos esse protocolo mais importante para a sua comparativamente baixa taxa de mortalidade, uma rápida recuperação e reprodutibilidade dos resultados. O modelo de prisão / ressuscitação cardíaca é sem dúvida o model…

Materials

			Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
			Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
			Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
			Software
ImageJ	NIH