2 पोत रोड़ा / Hypotension: ग्लोबल मस्तिष्क ischemia की चूहा मॉडल
Summary
प्रणालीगत हाइपोटेंशन के साथ मिलकर द्विपक्षीय मन्या रोड़ा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गंभीरता के साथ हिप्पोकैम्पस को नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप, चूहे में वैश्विक मस्तिष्क ischemia के उत्पादन करता है. पशु विषयों मस्तिष्क क्षति की उम्मीद के मुताबिक पैटर्न के साथ प्रभावित कर रहे हैं, वे जल्दी से ठीक हो, और मृत्यु दर अपेक्षाकृत कम होता है.
Abstract
Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.
Introduction
हृदय की गिरफ्तारी और स्ट्रोक का एक परिणाम के रूप में मस्तिष्क क्षति मृत्यु और लंबी अवधि विकलांगता का एक प्रमुख कारण है. हृदय की गिरफ्तारी के शिकार लोगों के लिए हृदय पुनर्जीवन इन रोगियों के 60% के बाद अस्पताल में मर जाते हैं तो कम से कम व्यापक मस्तिष्क क्षति का एक परिणाम के रूप में अमेरिका 7,8 में प्रति वर्ष लगभग 70,000 रोगियों में सहज संचलन बहाल करने में सफल होता है और जबकि केवल 3-10% पुनर्जीवित रोगियों की 9,10 अपने पूर्व जीवन शैली को फिर से शुरू कर सकते हैं. जाहिर है, वैश्विक मस्तिष्क ischemia के बाद और तंत्रिका संबंधी आघात को कम करने के लिए उपचारात्मक उपायों डिजाइनिंग मस्तिष्क क्षति के लिए नेतृत्व कि तंत्र को समझने के महत्व का है.
मस्तिष्क ischemia के कई तरीकों का उपयोग मॉडलिंग की जा सकती. सबसे अधिक, मस्तिष्क ischemia के इस तरह एक केंद्र इस्कीमिक स्ट्रोक 11,12 उत्पादन, मस्तिष्क, मध्य मस्तिष्क धमनी में एक प्रमुख रक्त वाहिका occluding द्वारा कृंतक में उत्पादन किया है. नैदानिक महत्वपूर्ण जबकि,फोकल मस्तिष्क ischemia के हृदय की गिरफ्तारी / पुनर्जीवन द्वारा उत्पादित मस्तिष्क क्षति का अध्ययन करने का सही तरीका नहीं है. इस नैदानिक प्रतिमान मॉडल को पूरे मस्तिष्क इस्कीमिक रक्त प्रवाह के reintroduction द्वारा पीछा किया जाना चाहिए. बारीकी से इस नैदानिक प्रस्तुति की नकल करने के लिए, जांचकर्ताओं प्रयोगात्मक सीपीआर और defibrillation 13,14 साथ पुनर्जीवन द्वारा पीछा हृदय की गिरफ्तारी प्रेरित. इस मॉडल नैदानिक प्रासंगिक है, लेकिन अप्रत्याशित पुनर्जीवन बार परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकते हैं और व्याख्या करने के लिए डेटा विश्लेषण कठिन बना सकता है. इसके अतिरिक्त, इस मॉडल के आगे एक परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए आवश्यक पशु संख्या बढ़ रही है, एक उच्च मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है. एक अधिक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संगत, और survivable अपमान में वैश्विक ischemia और / या reperfusion के लिए मस्तिष्क की प्रतिक्रिया की जांच कर पसंद किया जा सकता.
प्रणालीबद्ध कुछ रक्त के प्रवाह को बनाए रखने, जबकि ग्लोबल ischemia के मस्तिष्क में प्रेरित किया जा सकता है. Investigatio अनुमति देता है, जबकि मृत्यु दर को कम कर देता हैएन मस्तिष्क 2 में ऊतकों को नुकसान के तंत्र की. वैश्विक मस्तिष्क ischemia के उत्पादन के लिए, यह बीच में या बहुत मस्तिष्क, आंतरिक मन्या धमनियों और कशेरुका धमनियों की आपूर्ति करने वाले सभी चार जहाजों में प्रवाह को सीमित करने के लिए आवश्यक है. इन जहाजों में एक anastomotic पाश रूपों जो विलिस के सर्किल नामक एक संवहनी संरचना के माध्यम से रक्त के प्रवाह के साथ मस्तिष्क की आपूर्ति. इस संवहनी वास्तुकला मस्तिष्क समीपस्थ संवहनी रोड़ा की घटना में छिड़काव बनाए रखने के लिए अनुमति देता है. इसलिए, सभी अंशदायी वाहिकाओं के माध्यम से मस्तिष्क, रक्त प्रवाह की पूरी ischemia के लिए प्रेरित करना चाहिए होते हैं. कैरोटिड धमनी रोड़ा एक वांछित अवधि के लिए धमनीविस्फार क्लिप का एक न्यूनतम इनवेसिव उदर गर्दन कट नीचे और अनुप्रयोग का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है. वे कशेरुका स्तंभ की अनुप्रस्थ foramina में incased रहे हैं कशेरुका धमनियों के माध्यम से रक्त के प्रवाह में रुकावट, मुश्किल हो सकता है. जांचकर्ता मन्या से पहले कशेरुका धमनियों 24-48 घंटा electrocauterizing द्वारा इस को संबोधित कियारोड़ा और मस्तिष्क ischemia (4VO मॉडल) 15. इस दृष्टिकोण के विपरीत, स्मिथ एट अल. को कम करने से वैश्विक मस्तिष्क ischemia के उत्प्रेरण रक्त प्रवाह 2 खो दिया है या बहुत कम है जहां एक मुद्दे पर कशेरुका धमनियों के माध्यम से छिड़काव कम करने के लिए 40 mmHg को प्रणालीबद्ध धमनी रक्तचाप (एमएपी) मतलब है की एक विधि विकसित . मन्या रोड़ा साथ युग्मित, इस विधि का बारीकी से हृदय की गिरफ्तारी के बचे कि mimics कि मस्तिष्क क्षति की एक पद्धति है, जिसके परिणामस्वरूप अग्रमस्तिष्क भर ischemia के उत्पादन करता है. इस पद्धति का एक और शोधन में, हम यहां उपस्थित मॉडल 30 mmHg पर तंग एमएपी विनियमन ± 1mHg ischemia के पूरे 8 मिनट के दौरान की आवश्यकता है. हम स्मिथ एट अल द्वारा डिजाइन मूल तकनीक का कम मृत्यु दर के संरक्षण, जबकि इस परिवर्तन के इस मॉडल से प्रेरित मस्तिष्क क्षति के reproducibility बेहतर बनाता पाया.
कोशिका मृत्यु और ऊतकों को नुकसान की समग्र सीमा के सटीक फेनोटाइप के कारणयहाँ प्रस्तुत मॉडल इस्कीमिक अवधि 16 पर सीधे निर्भर हैं. सीए 1 न्यूरॉन्स reperfusion की चरण 15,17 दौरान चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए एक अस्थायी खिड़की है, सुझाव है कि कोशिका मृत्यु में देरी, ischemia के 8 मिनट एक्ज़िबिट बाद. Reperfusion के शुरुआत में, न्यूरॉन्स जल्दी समारोह पाने और कोई तत्काल कोशिका मृत्यु 18 detectable है. हालांकि इस अपमान का कारण बनता है कोशिका मृत्यु cascades की प्रेरण (apoptosis) के उस reperfusion की 3,19 के 4-6 घंटे के बीच साइटोक्रोम ग, सहित माइटोकांड्रिया से apoptogenic प्रोटीन की रिहाई में culminate. Reperfusion के घंटा 6 और 24 के बीच, सीए 1 हिप्पोकैम्पस के न्यूरॉन्स सेल निधन के लिए प्रतिबद्ध है, और apoptotic सेल मौत कार्यक्रम 19 को मार डाला है. यह इस्कीमिक चोट के लिए जिम्मेदार कोशिका मृत्यु फेनोटाइप बेहद विवादास्पद है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. अन्य दूसरों apopt रिपोर्ट जबकि प्रारंभिक अध्ययन, परिगलन प्राथमिक कोशिका मृत्यु फेनोटाइप 20,21 है सुझाव दिया हैप्रिंसिपल तंत्र 22,23 रूप Osis. कुल में, मौजूदा सबूत कोशिकाओं क्लासिक apoptosis से नेक्रोसिस को लेकर सेल मौत phenotypes की एक स्पेक्ट्रम के मरने का सुझाव है कि. कोशिका मृत्यु के विशिष्ट विधा प्रत्येक phenotype के योगदान की डिग्री अन्य कारकों 24,25 बीच, अपमान की गंभीरता पर निर्भर करता है के साथ, कई कारकों पर निर्भर है. Reperfusion के 24 घंटे से, मर कोशिकाओं pyknotic नाभिक, एकत्रित सेलुलर सामग्री के स्पष्ट सबूत के साथ संघनित साइटोसॉल, और कार्यात्मक मितोचोन्द्रिअल आकारिकी की हानि होती है. मृत कोशिकाओं को आगे, टूट ऐसी मैक्रोफेज और / या microglia के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं से घिरा हुआ है, और सीए 1 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र से मंजूरी दे दी है. Reperfusion के 4-7 दिनों तक, मृत कोशिकाओं को निकाल दिया, और सब कि रहता भड़काऊ कोशिकाओं रहे हैं और glial कोशिकाओं 17,26 सक्रिय कर रहे हैं. इसलिए, reperfusion के 7 दिनों सीए 1 हिप्पोकैम्पस neuronal मौत में सरल, गैर विशिष्ट सेल दाग का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है जहां एक इष्टतम समय का प्रतिनिधित्व करता हैcresyl बैंगनी या hemotoxylin-eosin समेत और शब्द के भागों शामिल किए जाने के मानदंडों के आधार पर गिना. यह देर से reperfusion के अंतराल में शेष कोशिकाओं को इस प्रकार मस्तिष्क क्षति की एक सूची प्रदान करते हैं, जीवित कोशिकाओं के रूप में गिना जा सकता है.
इस मॉडल उपचारात्मक उपायों का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा रहा है, यह प्रयोगात्मक डिजाइन सीढ़ी मापदंड (स्ट्रोक थेरेपी शैक्षणिक उद्योग गोलमेज) 27 पालन का सुझाव दिया है. डिजाइन और एक अध्ययन का आयोजन होता है जब इन दिशानिर्देशों का पालन किया जाना चाहिए, लेकिन यहाँ पर चर्चा नहीं कर रहे हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित मॉडल मनुष्यों में पाया गया है कि इसी तरह एक चोट प्रदान करने, हृदय की गिरफ्तारी और पुनर्जीवन का एक परिणाम के रूप में हो सकता है कि मस्तिष्क के लिए एक इस्कीमिक अपमान पैदा करता है. वैश्विक मस्ति…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | |||
| 5-0 VICRYL suture, reverse cutting | Ethicon | J391H | |
| Scalpel, No.10 | Swann-Morton | 6601 | |
| Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| 18G x 1 ½ in needle | BD | 305201 | |
| 23G x 1 in needle | BD | 305145 | |
| 26 G x 3/8 in needle | BD | 305110 | |
| 18 G x 1 ¼ catheter | EXEL | 26735 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| Surgilube | Henry Schein | 1152666 | |
| .9% Saline, plastic IV bag | Henry Schein | 1537468 | |
| Suture 3-0 Silk | Henry Schein | 1007842 | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Henry Schein | 3390017 | |
| Betadine | Henry Schein | 6903564 | |
| Sterile Towel Drape | Moore Medical | 14170 | |
| Polyethylene Tubing, 50 | Intramedic | 427411 | |
| Stopcock, 3 way | Smiths medical | MX9311L | |
| Drug Name | |||
| AERRANE (isoflurane) | Henry Schein | 2091966 | |
| Mapap Liquid (Tylenol) | Major Pharmaceuticals | 1556 | |
| Kedavet (ketamine) | Ketathesia Butney | NDC 50989-996-06 | |
| Butorphic (butorphanol) | Lloyd Labs | 4881 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 504011 | |
| Chemical Name | |||
| Paraformaldehyde prills | Elecron Microscopy Sci. | 19202 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 270342 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma | C5042 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH |
References
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