2-Vessel Okklusjon / Hypotensjon: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Summary

Bilateral carotis okklusjon kombinert med systemisk hypotensjon produserer global hjerne iskemi hos rotte, noe som resulterer i skader på hippocampus med reproduserbare alvorlighetsgrad. Er dyr fag svekket med forutsigbare mønstre av hjerneskade, gjenopprette de hensiktsmessig, og dødelighet er relativt lave.

Abstract

Hjertestans etterfulgt av gjenoppliving ofte resulterer i dramatisk hjerneskade forårsaket av ischemi og påfølgende reperfusjon av hjernen. Global hjerne iskemi produserer skade på bestemte områder av hjernen vist seg å være svært følsomme for iskemi ^en. Hippokampale neuroner har høyere følsomhet for ischemiske fornærmelser sammenlignet med andre cellepopulasjoner, og spesielt er den CA1 regionen av hippocampus særlig utsatt for ischemi / reperfusjon ^2..

Utformingen av terapeutiske intervensjoner, eller studie av mekanismene som er involvert i cerebral skade, krever en modell som produserer skade lik den kliniske tilstand, og på en reproduserbar måte. Bilateral carotis fartøy okklusjon med hypotensjon (2VOH) er en modell som produserer reversibel forhjerne iskemi, etterligning cerebrale hendelser som kan oppstå under hjertestans og gjenopplivning. Vi beskriver en modell modifisert fra Smith et al. (1984) ², Som først ble presentert i sin nåværende form i Sanderson et al. (2008) ^3, som produserer reproduserbar skade selektivt sårbare områder av hjernen ^3-6. Påliteligheten av denne modellen er diktert av presis kontroll av systemisk blodtrykk under anvendt hypotensjon, varigheten av iskemi, tett temperaturkontroll, en bestemt anestesi diett, og flittig postoperativ omsorg. 8 minutters iskemisk fornærmelse produserer celledød av CA1 hippocampus nevroner som utvikler seg i løpet av 6-24 timer av reperfusjon, mens mindre sårbare områder av hjernen er spart. Denne progressive celledød enkelt kvantifisert etter 7-14 dager med reperfusjon, som et nesten fullstendig tap av CA1-neuroner er tydelig på dette tidspunktet.

I tillegg til dette hjerneskade modell, presenterer vi en metode for CA1 skade kvantifisering ved hjelp av en enkel, men grundig, metodikk. Viktigere, kan kvantifisering oppnås ved hjelp av et enkelt kamera montert mikroskop, enda gratis ImageJ (NIH) programvare plugin, obviating behov for kostnadseffektive uoverkommelige stereology programmer og en motorisert mikroskopisk scene for skadevurdering.

Introduction

Hjerneskade som følge av hjertestans og hjerneslag er en ledende årsak til død og langsiktig uførhet. Mens hjerte-lungeredning for ofre for hjertestans lykkes i å gjenopprette spontan sirkulasjon i ca 70 000 pasienter per år i USA ^7,8 minst 60% av disse pasientene senere dør på sykehuset som følge av omfattende hjerneskade og bare 3-10% av gjenopplivet pasienter kan gjenoppta sin tidligere livsstil ^9,10. Åpenbart forstå mekanismene som fører til hjerneskade etter global hjerne iskemi og utforme terapeutiske intervensjoner for å redusere nevrologiske traumer er av avgjørende betydning.

Hjerne-ischemi kan modelleres benytte flere metoder. Det vanligste er at hjerne-ischemi produsert i gnagere ved å blokkere en vesentlig blodkar i hjernen, den midtre cerebralarterie, og dermed produsere en focal ischemisk slag ^11,12. Mens klinisk viktig,fokal hjerne-ischemi er ikke en nøyaktig metode for å studere hjerneskade produsert av hjertestans / lunge-redning. For å modellere denne kliniske paradigmet hele hjernen må gjøres iskemisk etterfulgt av gjeninnføring av blodstrøm. Å nøye etterligne denne kliniske presentasjon, etterforskere eksperimentelt indusere hjertestans etterfulgt av gjenoppliving med HLR og defibrillering ^13,14. Denne modellen er klinisk relevant, kan imidlertid uforutsigbare gjenoppliving ganger øke variasjon og kan gjøre dataanalyse vanskelig å tolke. I tillegg er denne modellen forbundet med en høy dødelighet, som ytterligere øker antall dyr er nødvendig for å teste en hypotese. Gransker cerebral respons på global iskemi og / eller reperfusion i en mer reproduserbar, konsekvent og survivable fornærmelse kan bli foretrukket.

Global ischemi kan induseres i hjernen og samtidig bevare noen blodstrøm systemisk. Dette reduserer dødeligheten, samtidig som investigation av mekanismene for vevsskade i hjernen ^to. For å produsere den globale hjerne-ischemi, er det nødvendig å avbryte eller i stor grad begrense strømning i alle fire kar som forsyner hjernen, den indre karotid-arteriene og vertebrale arterier. Disse fartøyene forsyne hjernen med blod flyte gjennom en vaskulær struktur kalt Circle of Willis, som danner en anastomotisk loop. Denne vaskulære arkitekturen gjør hjernen for å beholde perfusjon i tilfelle proksimale vaskulær okklusjon. Derfor må for å indusere fullstendig iskemi i hjernen, blodstrømmen gjennom alle medvirkende fartøyer forekommer. Halspulsåren okklusjon kan oppnås ved hjelp av en minimal invasiv ventral utsnitt ned og anvendelse av aneurisme klipp for en ønsket periode. Avbrudd av blodstrømmen gjennom de vertebrale arterier kan være vanskelig, slik de er incased i tverrgående foramina av virvelsøylen. Etterforskerne har adressert dette ved electrocauterizing ryggvirvel arteries 24-48 hr før carotisokklusjon og hjerne iskemi (4VO modell) ^15. I motsetning til denne metode, som er utviklet Smith et al. Metode for å indusere en global hjerne-ischemi ved å redusere det gjennomsnittlige arterielle blodtrykk (MAP) systemisk til 40 mmHg for å redusere perfusjon gjennom de vertebrale arterier til et punkt hvor blodstrømmen er tapt eller sterkt redusert ² . Når kombinert med carotis okklusjon, produserer denne metoden iskemi hele forhjerne, noe som resulterer i et mønster av hjerneskade som etterligner det av hjertestans overlevende. I en videreutvikling av denne fremgangsmåte, krever modellen presenterer vi her tett MAP regulering ved 30 mmHg ± 1mHg under hele 8 min av iskemi. Vi fant denne endring forbedrer reproduserbarhet av hjerneskade indusert av denne modell og samtidig bevare den lave dødeligheten av den opprinnelige teknikk utviklet av Smith et al.

Den nøyaktige fenotype av celledød og totale omfanget av vevsskader forårsaket avden modellen som er presentert her er direkte avhengige av iskemisk varighet ^16.. Etter åtte minutter av iskemi, utstillingsområde CA1 nevroner forsinket celledød, noe som tyder på at det er en temporal vindu for terapeutisk intervensjon under reperfusjon fase ^15,17. Ved utbruddet av reperfusjon, nevroner raskt gjenvinne funksjon og ingen umiddelbar celledød er synlig ^18. Men denne fornærmelse fører til induksjon av celledød kaskader (apoptose) som kulminerer i utgivelsen av apoptogenic proteiner fra mitokondriene, inkludert cytokrom c, mellom 4-6 timer av reperfusjon ^3,19. Mellom 6 og 24 timer av reperfusjon, har nevroner av CA1 hippocampus forpliktet til celle død, og celledød ved apoptose programmet kjøres ^19. Det bør bemerkes at celledød fenotype ansvarlig for iskemisk skade er svært kontroversiell. Tidlige studier har antydet nekrose er den primære celledød fenotype ^20,21, mens andre andre rapporterer apoptosis som rektor mekanismen ^22,23. Totalt gjeldende bevis tyder på at celler dør av et spekter av celledød fenotyper som spenner fra klassisk apoptose til nekrose. Den spesifikke modusen for celledød er avhengig av mange faktorer, med graden av bidraget fra hver fenotype, avhengig av alvorlighetsgraden av fornærmelse, blant andre faktorer ^24,25. Ved 24-timers av reperfusjon, døende celler besitter pyknotic kjerner, kondensert cytosol med klare bevis for aggregerte cellulære innholdet, og tap av funksjonelle mitokondrie morfologi. Døde celler er videre brutt ned, omsluttet av immunceller som makrofager og / eller microglia, og fjernes fra CA1 hippocampus regionen. Ved 4-7 dager reperfusion, er døde celler fjernes, og alt som gjenstår er betennelsesceller og aktivert gliaceller ^17,26. Derfor representerer syv dager reperfusion en optimal tid hvor CA1 hippocampus neuronal død kan kvantifiseres ved hjelp av enkle, ikke-spesifikke celle flekker icluding Cresyl fiolett eller hemotoxylin-eosin og telles basert på morfologiske inklusjonskriteriene. Celler gjenværende på dette sene reperfusion intervall kan regnes som overlevende celler, og dermed gi en indeks for hjerneskade.

Ved denne modell er å bli utnyttet for å teste terapeutiske intervensjoner, er det foreslått at den eksperimentell design følge trappetrinn kriterier (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) ^27. Disse retningslinjer skal følges ved utforming og gjennomføring av en studie, er imidlertid ikke diskutert her.

Protocol

En. Forberedelse Alle dyreforsøk må følge institusjonelle retningslinjer og motta godkjenning av en respektiv dyr omsorg komité før oppstart. Alle prosedyrer som presenteres her har blitt godkjent av Wayne State University Institutional Animal Care og bruk komité og følge retningslinjene på etisk behandling av dyr som fremsatt i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og den amerikanske regjeringen Prinsipper for Utnyttelse og vedlikehold av virveldyr som brukes i testing, forskning og…

Representative Results

Den 2VOH global modell av hjerne-ischemi / reperfusjon forårsaker neuronal død i CA1-regionen av hippocampus. Figur 2 representerer skade produsert ved 8 min for global hjerne-ischemi, behandlet 14 dager etter reperfusjon. Figurene 2A og 2B sammenligner hippocampi fra og forloren post-iskemisk hjerne, farget med Cresyl fiolett. Figur 2A viser en hippocampus fra en humbug-opererte rotte som viser normal morfologi, inkludert et intakt CA1. Figur…

Discussion

Modellen som er beskrevet her gir en iskemisk hån mot hjernen som kan oppstå som et resultat av hjertestans og gjenoppliving, noe som gir en skade lik den som finnes i mennesker. Denne fremgangsmåte for fremstilling av global hjerne-ischemi er en av flere protokoller. Vi bruker denne protokollen fremst for sin relativt lav dødelighet, rask gjenoppretting, og reproduserbare resultater. Den hjertestans / lungeredning modellen er uten tvil den mest klinisk relevant modell, men teknisk sett mest vanskelig å stadig repr…

Materials

			Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
			Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
			Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
			Software
ImageJ	NIH