إعداد كروموسوم من الخلايا المستزرعة
Summary
الكروموسومات يمكن عزلها عن الخلايا الحية مثل الخلايا اللمفية أو الخلايا الليفية الجلد، ومن الكائنات الحية بما فيها البشر أو الفئران. هذه الاستعدادات كروموسوم يمكن استخدامها لمزيد من الروتين G-النطاقات والإجراءات الوراثية الخلوية الجزيئية مثل مضان التهجين في الموقع (FISH) في والتهجين الجينومي المقارن ([ك])، وتنميط نووي الطيفية (SKY).
Abstract
ويستخدم على نطاق واسع الصبغي (خلوي) تحليل للكشف عن عدم الاستقرار كروموسوم. عندما تليها G-النطاقات والتقنيات الجزيئية مثل مضان التهجين في الموقع (FISH) في، هذا الاختبار لديه القدرة قوية لتحليل الخلايا الفردية للالانحرافات التي تنطوي على مكاسب أو خسائر من أجزاء من الجينوم والتي تنطوي على إعادة ترتيب الكروموسومات واحد أو أكثر. في البشر، وتحدث تشوهات صبغية في حوالي 1 في 160 ولادة حية 1،2، 60-80٪ من جميع حالات الإجهاض 3،4، 10٪ من حالات الإملاص 2،5، 13٪ من الأفراد الذين يعانون من أمراض القلب الخلقية 6، 3-6٪ من حالات العقم 2، وفي كثير من المرضى الذين يعانون من تأخر في النمو والعيوب الخلقية 7. ويستخدم التحليل الوراثي الخلوي الخباثة بشكل روتيني من قبل الباحثين والأطباء، كما تبين من الملاحظات شذوذ الكروموسومات نسيلي أن يكون أهمية التشخيص والنذير كلا 8،9.60؛ كروموسوم العزلة لا تقدر بثمن للعلاج بالجينات وأبحاث الخلايا الجذعية من الرئيسيات غير البشرية بما في ذلك الكائنات الحية والقوارض 10-13.
الكروموسومات يمكن أن تكون معزولة من خلايا الأنسجة الحية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية في الدم، والخلايا الليفية الجلدية، amniocytes، والمشيمة، ونخاع العظام، وعينات الورم. ويتم تحليل الكروموسومات في المرحلة الطورية من الانقسام، وعندما تشتد مكثف، وبالتالي فإنها مرئية أكثر وضوحا. الخطوة الأولى للتقنية الكروموسوم العزلة ينطوي على اضطراب في ألياف المغزل قبل الحضانة مع Colcemid، لمنع الخلايا من الانتقال إلى مرحلة لاحقة طور الصعود. ثم يتم التعامل مع الخلايا مع حل ناقص التوتر والحفاظ عليها في حالة تورم مع تثبيتي في كاروني. ثم يتم إسقاط الخلايا إلى الشرائح ويمكن بعد ذلك أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الإجراءات. G-النطاقات ينطوي العلاج التربسين تليها تلطيخ مع بالغيمزا لخلق ضوء مميزة وعصابات الظلام. نفس العلاقات العامةocedure لعزل الكروموسومات يمكن استخدامها لإعداد الخلايا لإجراءات مثل مضان التهجين في الموقع (FISH) في والتهجين الجينومي المقارن ([ك])، وتنميط نووي الطيفية (SKY) 14،15.
Introduction
تحليل الكروموسومات هي تقنية تستخدم في جميع أنحاء العالم التقليدية لتشخيص عدم الاستقرار وإعادة ترتيب الكروموسومات مما يؤدي إلى الاضطرابات الوراثية والأورام الخبيثة 1،2،8،9. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق دقة أعلى لتشخيص والبحوث من خلل وراثي دستوري والمكتسبة السرطان مع مجموعة من الإجراءات والمنهجيات الكلاسيكية خلوي خلوي الجزيئية مثل مضان التهجين في الموضع (FISH)، التهجين الجينومي المقارن ([ك]) ، وتنميط نووي الطيفية (SKY) 14،15. في الآونة الأخيرة، وقد تم استخدام هذه التقنيات لتقييم عدم الاستقرار الصبغي المرتبطة أبحاث الخلايا الجذعية. وقد تم الإبلاغ عن تشوهات مثل عدم توازن الصبغيات النمط النووي للخلايا طويلة الأجل مثقف الجنينية (ES) والخلايا الجذعية البالغة من الكائنات الحية المختلفة من قبل مختبرات متعددة. يدعم الأدلة الحديثة أن بعض خطوط الخلايا هي بطبيعتها أكثر ميلا للكروموسوم instability بغض النظر عن الظروف الثقافة. لهذا السبب، عند إنشاء و / أو الحفاظ على خطوط الخلايا الجذعية القرد الإنسان، والماوس، أو، فمن المستحسن تحليل كروموسوم كجزء من عملية مراقبة الجودة. وصف العديد من التقارير على الاهتمام المتزايد في استخدام علم الوراثة الخلوية والجزيئية روتينية لمراقبة الاستقرار الكروموسومات من الخلايا الجذعية والخلايا الخبيثة أو الكائنات المختلفة في الثقافة 10-13. ويتزايد استخدام هذه البروتوكولات من قبل مختبرات غير الوراثية لتقييم الكروموسومات السريع لزنازينهم مثقف 13. نقدم الإجراءات الأساسية لدينا لإعداد كروموسوم من أنواع الخلايا المختلفة، والتي يمكن تطبيقها لكلا الغرضين والخلايا السريرية والبحوث المستمدة من الكائنات الحية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد استخدمت الإجراء الحالي لكروموسوم بمعزل عن خلايا الكائنات الحية المختلفة، بما في ذلك أنواع مختلفة خلية تم الحصول عليها من الإنسان، المكاك وهو قرد اسيوي والجرذان، والفئران 11،20-22. يتم توفير بروتوكول قياسي، ولكن قد يحتاج بعض الخطوات الرئيسية والمتغيرات التي ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدم العمل المبين في هذا المخطوط بفضل تمويل من مؤسسة باتريك تايلور F..
Materials
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
References
- Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
- Nussbuam, R., et al. . Genetics in Medicine: 7th Edition. , 76 (2007).
- Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
- Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
- Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
- Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
- Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21.. PubMed Health. , (2010).
- Cin, P. D. . Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
- Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
- Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
- Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
- Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
- Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
- Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
- Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
- Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. . Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
- Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. . The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , (1997).
- Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J., McClatchey, K. D. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. , 658-685 (2002).
- Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
- Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22–>qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
- Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
- McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).
