Kromosom Forberedelse Fra dyrkede celler

Summary

Kromosomer kan bli isolert fra levende celler slik som lymfocytter eller hudfibroblaster, og fra organismer inkludert mennesker eller mus. Disse kromosompreparater kan videre benyttes for rutinemessig G-banding og molekylære cytogenetiske prosedyrer som for eksempel fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH), og spektral karyotyping (SKY).

Abstract

Kromosom (cytogenetisk) analyse er mye brukt for påvisning av kromosom ustabilitet. Ved etterfulgt av G-striper og molekylære teknikker som fluorescens in situ hybridisering (FISH), har denne analysen den kraftige evne til å analysere de enkelte celler for forstyrrelser som involverer gevinster eller tap av deler av genomet, og rearrangementer som omfatter en eller flere kromosomer. Hos mennesker, kromosomfeil forekommer hos ca 1 pr 160 levendefødte ^1,2, 60-80% av alle spontanaborter ^3,4, 10% av dødfødsler ^2,5, 13% av personer med medfødt hjertesykdom ^6, 3-6% av ufruktbarhet tilfeller ^to, og i mange pasienter med forsinket utvikling og fødselsskader ^7. Cytogenetisk analyse av malignitet er rutinemessig brukt av forskere og klinikere, som observasjoner av klonale kromosomavvik har vist seg å ha både diagnostisk og prognostisk betydning ^8,9.60; Kromosom isolasjon er uvurderlig for genterapi og stamcelleforskning organismer, inkludert ikke-menneskelige primater og gnagere ^10-13.

Kromosomer kan bli isolert fra celler av levende vev, inkludert blod-lymfocytter, hudfibroblaster, amniocytes, placenta, benmargen, og vevsprøver. Kromosomene er analysert ved meta stadium av mitose, når de er mest kondensert og derfor mer synlig. Det første trinn i kromosomet isolasjon teknikken innebærer oppbrytning av spindefibre ved inkubasjon med Colcemid, for å hindre at celler fra å gå frem til det etterfølgende anaphase stadium. Cellene blir deretter behandlet med en hypoton løsning og bevart i sin utvidete form med Carnoy sin fikseringsmiddel. Cellene blir deretter slippes på ved sidene, og kan deretter benyttes for en rekke prosedyrer. G-banding omfatter trypsin behandling etterfulgt av farging med Giemsa å skape karakteristisk lys og mørke striper. Den samme procedure å isolere kromosomer kan anvendes for fremstilling av celler for prosedyrer som for eksempel fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH) og spektral karyotyping (SKY) ^14,15.

Introduction

Kromosomanalyse er en konvensjonell teknikk benyttes over hele verden til å diagnostisere kromosom ustabilitet og rearrangements fører til genetiske lidelser og malignitet ^1,2,8,9. I tillegg kan en høyere oppløsning for diagnose og forskning av konstitusjonelle og kreft-ervervet genetiske avvik oppnås med en kombinasjon av de klassiske cytogenetiske prosedyrer og molekylære cytogenetiske metoder som fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH) , og spektral karyotyping (SKY) ^14,15. I den senere tid har disse teknikker blitt benyttet for evaluering av kromosom ustabilitet forbundet med stamceller. Karyotypic abnormaliteter som aneuploidy av langsiktige dyrkede embryonale celler (ES) og voksne stamceller av ulike organismer har blitt rapportert av flere laboratorier. Nyere bevis støtter at noen cellelinjer er iboende mer tilbøyelig til kromosom instabiLity uavhengig av kultur forhold. Av denne grunn, ved å etablere og / eller opprettholde menneske, mus eller Rhesus stamcellelinjer, er kromosom analyse anbefalt som en del av kvalitetskontrollen. Mange rapporter beskriver den økende interesse for bruk av rutinemessige og molekylære cytogenetikk å overvåke det kromosomale stabiliteten av stamceller og maligne celler eller forskjellige organismer i kulturen ^10-13. Disse protokollene er i økende grad blir brukt av nongenetic laboratorier for rask kromosom vurdering av sine dyrkede celler ^13. Vi presenterer våre grunnleggende prosedyrer for kromosom forberedelse fra ulike celletyper, som kan brukes for både klinisk og forskningsformål og celler som stammer fra ulike organismer.

Protocol

En. Kromosom Høsting av heftende celler Standard protokoll Grow celler i henhold til bestemte celledyrking forhold. Når cellene har nådd logaritmisk fase (80% konfluens), tilsett 10 ul / ml av Colcemid til cellekulturkolbe. Et minimum på 2 x 10 celler 6 er anbefalt. Inkuber cellene ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 45 min. Ved hjelp av en steril pipette, overføre media fra cellene til en 15 ml konisk tube. Sett til side. Forsiktig vask…

Representative Results

Høy kvalitet metafase spreads er avgjørende for kromosomanalyse. En vellykket analysen gir kromosomer som er godt spredt og av egnet kromosom morfologi. Riktig G-båndede kromosomer inneholder den karakteristiske lyse og mørke båndmønstrene. Figur 1. Vellykket kromosomal spredning hvori kromosome…

Discussion

Vi har benyttet dagens prosedyre for kromosom isolert fra celler av ulike organismer, inkludert ulike celletyper hentet fra menneske, rhesus-aper, rotter og mus ^11,20-22. Standarden protokollen er gitt, men enkelte viktige skritt og variabler kan være nødvendig å justere for disse ulike typer celler. Flere konkrete tiltak er avgjørende både i kromosom forberedelse og G-banding for å sikre best mulig kvalitet på resultatene. En av de variable som kan påvirke analysen, er den Colcemid inkubasjonstid. Ut…

Materials

KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS Buffer	Gibco	24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Buffer Tablets "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Centrifuge 5810	Eppendorf
Methanol	Caledon Laboratory Chemicals	6700130
Glacial Acetic Acid	Krackeler Scientific Inc.	11-9508-05