Kromosom Förberedelser från odlade celler

Summary

Kromosomer kan isoleras från levande celler, såsom lymfocyter eller fibroblaster från hud, och från organismer, inklusive människor eller möss. Dessa kromosompreparat kan utnyttjas ytterligare för rutin G-bandning och molekylära cytogenetiska förfaranden såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), jämförande genomisk hybridisering (CGH), och spektral karyotypning (SKY).

Abstract

Kromosom (cytogenetisk) analys används i stor utsträckning för att upptäcka kromosom instabilitet. När följt av G-bandning och molekylära tekniker såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), har denna analys den kraftfulla förmåga att analysera enskilda celler för avvikelser som innebär vinster eller förluster av delar av genomet och omdisponeringar som omfattar en eller flera kromosomer. Hos människor, kromosomavvikelser förekommer hos cirka 1 per 160 levande födda ^1,2, 60-80% av alla missfall ^3,4, 10% av dödfödda ^2,5, 13% av individer med medfödd hjärtsjukdom ^6, 3-6% av infertilitet fall ^2, och i många patienter med utvecklingsförsening och fosterskador ^7. Cytogenetisk analys av malignitet rutin används av forskare och kliniker, som observationer av klonala kromosomavvikelser har visat sig ha både diagnostiska och prognostiska betydelsen ^8,9.60; Kromosom isolering är ovärderlig för genterapi och stamcellsforskning av organismer, inklusive icke-mänskliga primater och gnagare ^10-13.

Kromosomer kan isoleras från celler av levande vävnader, inkluderande blodlymfocyter, hudfibroblaster, amniocyter, placenta, benmärg, och tumörprover. Kromosomer analyseras vid metafasstadiet vid mitos, när de mest kondenseras och därför är mer tydligt. Det första steget av kromosomen isoleringsteknik innebär avbrott i de spindelfibrer genom inkubation med Colcemid, för att förhindra cellerna från att fortsätta till den efterföljande anafas skede. Cellerna behandlades därefter med en hypoton lösning och bevaras i deras svällt tillstånd med Carnoys fixativ. Cellerna sedan släppas mot bilderna och kan sedan användas för en mängd olika förfaranden. G-banding innebär trypsin behandling följt av färgning med Giemsa att skapa karakteristiska ljusa och mörka band. Samma procedure att isolera kromosomer kan användas för framställning av celler för förfaranden såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), jämförande genomisk hybridisering (CGH), och spektral karyotypning (SKY) ^14,15.

Introduction

Kromosomanalys är en vanlig teknik som används över hela världen för att diagnostisera kromosom instabilitet och omorganiseringar som leder till genetiska sjukdomar och malignitet ^1,2,8,9. Dessutom kan en högre upplösning för diagnos och forskning av konstitutionella och cancer-förvärvade genetiska avvikelser uppnås med kombinationen av de klassiska cytogenetiska förfaranden och molekylära cytogenetiska metoder, t.ex. fluorescens in situ hybridisering (FISH), jämförande genomisk hybridisering (CGH) , och spektral karyotypning (SKY) ^14,15. På senare tid har dessa tekniker använts för utvärdering av kromosom instabilitet i samband med stamcellsforskning. Karyotypic störningar såsom aneuploidy långsiktiga odlade embryonala celler (ES) och vuxna stamceller av olika organismer har rapporterats av flera laboratorier. Nya bevis stöder att vissa cellinjer är till sin natur mer benägna att kromosom instabiLity oavsett odlingsbetingelser. Därför, när du upprättar och / eller underhålla människa, mus, eller Rhesus stamcellslinjer, är kromosomanalys rekommenderas som en del av kvalitetskontrollen. Många rapporter beskriver det ökande intresse för användning av rutinmässiga och molekylär cytogenetik att övervaka kromosomala stabilitet stamceller och maligna celler eller olika organismer i kultur ^10-13. Dessa protokoll används alltmer av nongenetic laboratorier för snabb kromosom bedömning av odlade celler ^13. Vi presenterar våra grundläggande rutiner för kromosom preparat från olika celltyper, som kan tillämpas för både kliniska och forskningsändamål och celler från olika organismer.

Protocol

1. Kromosom Skörd vidhäftande celler Standardprotokollet Odla celler enligt specifika cellodlingsbetingelser. När cellerna har nått logaritmisk fas (80% konfluens), tillsätt 10 | il / ml av Colcemid till cellodlingskolv. Ett minimum av 2 x 10 6 celler rekommenderas. Inkubera cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator under 45 min. Med hjälp av en steril pipett överföra media från celler i en 15 ml koniska rör. Ställ åt sidan. Tvä…

Representative Results

Metafas sprider Hög kvalitet är avgörande för kromosomanalys. En lyckad analys ger kromosomer som är väl spridda och i lämplig kromosom morfologi. Korrekt G-bandad kromosomer innehåller den karakteristiska ljusa och mörka bandmönster. Figur 1. En lyckad kromosomspridning där kromosomerna ä…

Discussion

Vi har använt detta förfarande för kromosom isolering från celler av olika organismer, inklusive olika celltyper som erhållits från human, rhesus macaques, råttor och möss ^11,20-22. Standardprotokollet är anordnad, men med vissa viktiga steg och variabler kan behöva justeras för dessa olika typer av celler. Flera specifika åtgärder är avgörande både i kromosomala förberedelse-och G-band för att säkerställa bästa möjliga kvalitet på resultaten. En av de variabler som kan påverka analyse…

Materials

KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS Buffer	Gibco	24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Buffer Tablets "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Centrifuge 5810	Eppendorf
Methanol	Caledon Laboratory Chemicals	6700130
Glacial Acetic Acid	Krackeler Scientific Inc.	11-9508-05