Scheiding van muis embryonale Facial ectoderm en mesenchym
Summary
Een protocol voor het scheiden van embryo gezichts ectoderm en mesenchym beschreven. We gebruiken Dispase II om eerst te behandelen hele embryo's, hele gezicht protuberansen ontleden, en dan scheiden de gezichts-ectoderm en mesenchym.
Abstract
Orofaciale schisis zijn de meest voorkomende craniofaciale defecten, waarvan 1,5 op 1.000 pasgeborenen wereldwijd 1,2. Orofaciale clefting wordt veroorzaakt door abnormale gezichtskenmerken ontwikkeling 3. Bij mens en muis, initiële groei en patroonvorming van het gezicht voert verschillende knopjes weefsel, het gezicht protuberansen 4,5. Het gezicht is afgeleid van zes grote protuberansen: gepaarde frontale neus processen (FNP), maxillaire protuberansen (MXP) en mandibulaire protuberansen (MDP). Deze uitsteeksels bestaan uit zwellingen mesenchym die zijn ingekapseld in een bovenliggende epitheel. Studies in meerdere species is gebleken dat signalering overspraak tussen gezichts ectoderm en mesenchym is cruciaal voor het vormen van het vlak 6. Toch zijn mechanistische gegevens over de genen die betrokken zijn bij deze signalering relais ontbreekt. Een manier om een beter begrip van gen-expressie te krijgen, transcriptiefactor binding en chromatine markeringen in verband met de ontwikping gezichts ectoderm en mesenchym is het isoleren en karakteriseren van de gescheiden weefselcompartimenten.
Hier wordt een werkwijze voor het scheiden gezichts ectoderm en mesenchym op embryonale dag (E) 10.5 kritisch ontwikkelingsstadium muis gezicht formatie fusie van de uitsteeksels voorafgaat. Onze methode is een bewerking van de aanpak die we eerder hebben gebruikt voor het ontleden van het gezicht uitsteeksels 7. In deze eerdere studie hadden we werkzaam inteelt C57BL / 6 muizen als deze stam is uitgegroeid tot een standaard voor de genetica, genomics en gezicht morfologie 8. Hier echter, vanwege de beperktere hoeveelheden weefsel beschikbaar hebben we gebruik gemaakt van de outbred CD-1 stam die goedkoper in aanschaf, robuuster voor veeteelt, en de neiging om meer embryo (12-18) per nest dan inteelt produceren muizenstam 8. Na isolatie embryo werd neutraal protease Dispase II gebruikt om de hele embryo behandelen. Vervolgens werden de gezichts uitsteeksels ontledened uit en het gezicht ectoderm werd gescheiden van het mesenchym. Deze methode houdt zowel de gezichts ectoderm en mesenchym intact. Monsters die met deze methode kan worden gebruikt voor technieken zoals eiwitdetectie, chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assay, microarray studies en RNA-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een eenvoudige methode om embryonale muis gezicht ectoderm en mesenchym op basis van een eerste Dispase II behandeling stap te scheiden. In eerdere studies hebben we uitgevoerd ontleding van het gezicht verhevenheden vóór Dispase II behandeling, maar we hebben consistent gevonden dat het mesenchym wordt "sticky" en moeilijk te manipuleren. Onze nieuwe protocol voorkomt dit probleem. Combinatie Dispase II behandeling met zachte fysieke geweld door en neer te pipetteren maakt scheiding van e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Irene Choi bedanken voor het illustreren van embryo hoofden in figuur 1 en de andere leden van het laboratorium voor hulp en discussie. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie DE012728 (TW)
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 – The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
