Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet
Summary
Das Vorhandensein von stabilen microRNAs (miRNAs) in exosomes hat immense Interesse als neue Art der interzellulären Kommunikation erzeugt, für ihre potenziellen Nutzen als Biomarker und als Weg für eine therapeutische Intervention. Hier zeigen wir exosome Reinigung von Blut und Kulturmedien durch quantitative PCR gefolgt, um miRNAs transportiert identifizieren.
Abstract
Stabile miRNAs sind in allen Körperflüssigkeiten und einige zirkulierenden miRNAs sind vor dem Abbau durch Sequestrierung in kleine Bläschen genannt exosomes geschützt. Exosomen mit der Plasmamembran, die zur Übertragung von RNA und Proteine an die Zielzelle fusionieren. Ihre biologische Funktionen umfassen Immunantwort Antigenpräsentation und intrazelluläre Kommunikation. Versand von miRNAs die Genexpression in den Empfänger-Zellen über das Blut regulieren kann hat neuartige Wege für die Ziel-Intervention eröffnet. Neben dem Angebot einer Strategie für die Verabreichung von Medikamenten oder RNA Therapeutika können exosomalen Inhalt als Biomarker, die bei der Diagnose helfen, Bestimmung Behandlungsmöglichkeiten und Prognose dienen können.
Hier werden wir das Verfahren für die quantitative Analyse von miRNAs und Boten-RNAs (mRNA) von Exosomen in Blut und Zellkulturmedien abgesondert beschreiben. Gereinigt wird exosomes gekennzeichnet mit Western-Blot-Analyse für exos werdenomal Marker und PCR für mRNAs von Interesse. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Immunogoldmarkierung wird verwendet, um exosomalen Morphologie und Integrität zu überprüfen. Gesamt-RNA aus diesen Exosomen gereinigt werden, um sicherzustellen, dass wir sowohl mRNA und miRNA aus derselben Probe studieren. Nach der Validierung durch RNA Integrität Bioanalyzer, führen wir einen mittleren Durchsatz quantitative real time PCR (qPCR), um die exosomalen miRNA TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten und Genexpressionsstudien für Transkripte von Interesse zu identifizieren.
Diese Protokolle können verwendet werden, um Änderungen in exosomalen miRNAs in Patienten, Nagermodellen und Zellkulturmedien vor und nach pharmakologische Intervention zu quantifizieren. Exosomalen Inhalte variieren aufgrund der Quelle des Ursprungs und den physiologischen Bedingungen der Zellen, die Sekretion von Exosomen. Diese Variationen können Einblick darüber, wie Zellen und Systeme mit Stress oder physiologische Störungen bewältigen zu stellen. Unsere repräsentative Daten zeigen variations in miRNAs präsentieren in Exosomen aus Maus-Blut, menschlichem Blut und Zellkulturmedien gereinigt.
Hier werden wir das Verfahren für die quantitative Analyse von miRNAs und Boten-RNAs (mRNA) von Exosomen in Blut und Zellkulturmedien abgesondert beschreiben. Gereinigt wird exosomes gekennzeichnet mit Western-Blot-Analyse für exosomalen Marker und PCR für mRNAs von Interesse sein. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Immunogoldmarkierung wird verwendet, um exosomalen Morphologie und Integrität zu überprüfen. Gesamt-RNA aus diesen Exosomen gereinigt werden, um sicherzustellen, dass wir sowohl mRNA und miRNA aus derselben Probe studieren. Nach der Validierung durch RNA Integrität Bioanalyzer, führen wir einen mittleren Durchsatz quantitative real time PCR (qPCR), um die exosomalen miRNA TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten und Genexpressionsstudien für Transkripte von Interesse zu identifizieren.
Diese Protokolle können verwendet werden, um Änderungen in exosomalen miRNAs quantifizieren in Patienten Nagermodellen und Zellkulturmedien vor und nach pharmakologische Intervention. Exosomalen Inhalte variieren aufgrund der Quelle des Ursprungs und den physiologischen Bedingungen der Zellen, die Sekretion von Exosomen. Diese Variationen können Einblick darüber, wie Zellen und Systeme mit Stress oder physiologische Störungen bewältigen zu stellen. Unsere repräsentative Daten zeigen Variationen in miRNAs präsentieren in Exosomen aus Maus-Blut, menschlichem Blut und Zellkulturmedien gereinigt
Introduction
Kurze kodierenden miRNAs die Genexpression durch Bindung an die Ziel-mRNA. Seed Sequenzkomplementarität von ~ 7 Basenpaaren ermöglicht miRNA in die Ziel-mRNA, was zur Inhibierung der Translation oder Verringerung der Stabilität der mRNA, die beide in einer verminderten Expression des Zielproteins 1 Ergebnis binden können. Forschung in den letzten zehn Jahren hat eindeutig eine fundamentale Rolle für miRNAs bei der Vermittlung zellulärer Funktionen bewährt. Es hat auch erhebliche Anstrengungen zur Sezieren miRNA vermittelten molekularen Veränderungen zugrunde liegen verschiedene Krankheiten 2,3 gerichtet. Außerdem ebnete kürzliche Identifizierung von stabilen miRNAs in Körperflüssigkeiten 4-6 den Weg für ihre Verwendung als neue Biomarker zugänglich klinische Diagnose.
Ein Modus von miRNA Transport in Körperflüssigkeiten ist via Exosomen, kleine Bläschen, die mRNAs tragen, Proteine, Lipidmediatoren und miRNAs an Empfänger Zellen über systemische Blut zirkulierendenion 7-14. Dies führt in der Modulation der Genexpression in Zellen des Empfängers und stellt einen neuen Mechanismus der zellulären Kommunikation. Zum Beispiel können Zellen modulieren immun-regulatorischen Prozesse durch Sekretion und / oder absorbierenden exosomes Biomoleküle enthaltenden in Entzündungen wie Interleukin-1β (IL1 &bgr;), Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) beteiligt, transformierender Wachstumsfaktor-β5 (TGFβ5) und die miRNAs, dass diese Gene regulieren 13. Wie aberrante miRNA Expression ist ein gemeinsames Merkmal in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, bieten diese Moleküle spannende neue Möglichkeiten für die Entdeckung und Validierung neuer therapeutischer Targets 2.
Zirkulierende miRNAs sind in allen Körperflüssigkeiten und es ist bekannt, dass die Zusammensetzung der verschiedenen exosomes ist, basierend auf den Source-Zellen, von denen sie gelöst. So bieten sie einen Weg, um den physiologischen Zustand der Zellen zu untersuchen und wie die Zellen zu verändern, auch Signalisierungts in Reaktion auf Stress einschließlich Krankheiten. Studieren Änderungen in exosome Zusammensetzung kann Einblick in die Signaltransduktion stellen und untersuchen ihr Potential als Biomarker Dienstprogramm oder therapeutische Intervention Routen.
Hier zeigen wir Ihnen die Reinigung von Exosomen aus mehreren Quellen auf veröffentlichten Protokollen. Diese exosomes wird für RNA-Isolierung durch qPCR gefolgt zu identifizieren und zu messen, die von miRNAs in den Exosomen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll, zeigen wir die Quantifizierung von miRNAs und mRNAs von Exosomen durch differentielle Zentrifugation von Blut-und Kulturmedien gereinigt. Exosomen haben diverse Komponenten abhängig von ihren Ursprungs sind und in einer Reihe von biologischen Funktionen, wie Immunreaktion, Antigenpräsentation, intrazelluläre Kommunikation und die Übertragung von RNA und Proteinen 9,11,12,19,20 beteiligt. Während Größe und Form ist eine Determinante der exosome Reinheit, zeigen eine Reihe von Papier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Mittel aus Rita Allen Foundation Zuschuss für Seena Ajit unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Erika Balogh und Dr. Soumitra Ghoshroy von der University of South Carolina Electron Microscopy Center for Instrument Gebrauch, wissenschaftliche und technische Unterstützung zu bestätigen.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
References
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