Rening och mikroRNA profilering av Exosomes härrör från blod och kultur Media
Summary
Förekomsten av stabila mikroRNA (miRNA) i exosomes har genererat stort intresse som ett nytt sätt att kommunikationen mellan, för deras potentiella användbarhet som biomarkörer och som en väg för terapeutisk intervention. Här visar vi exosome rening från blod och kultur media följt av kvantitativ PCR för att identifiera miRNA som transporteras.
Abstract
Stabila miRNA finns i alla kroppsvätskor och några cirkulerande miRNA skyddas från nedbrytning genom upptag i små blåsor som kallas exosomes. Exosomes kan smälta samman med plasmamembranet vilket resulterar i överföring av RNA och proteiner till målcellen. Deras biologiska funktioner inkluderar immunsvar, antigenpresentation och intracellulär kommunikation. Leverans av miRNA som kan reglera genuttryck i de mottagande cellerna via blodet har öppnat nya vägar för mål ingripande. Förutom att erbjuda en strategi för leverans av läkemedel eller RNA terapeutiska medel, kan exosomal innehållet fungera som biomarkörer som kan hjälpa vid diagnos, bestämma behandlingsalternativ och prognos.
Här kommer vi att beskriva förfarandet för att kvantitativt analysera miRNA och budbärar-RNA (mRNA) från exosomes utsöndras i blodet och cellodling. Renade exosomes kommer att karakteriseras med användning av western blot-analys för exosOMAL markörer och PCR för mRNA av intresse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) och immunogold märkning kommer att användas för att validera exosomal morfologi och integritet. Total RNA kommer att renas från dessa exosomes för att säkerställa att vi kan studera både mRNA och miRNA från samma prov. Efter validering RNA integritet genom Bioanalyzer, kommer vi utföra ett medium genomströmning kvantitativ realtids PCR (qPCR) för att identifiera exosomal miRNA med Taqman Low Density Array (TLDA) kort och gen studier uttryck för utskrifter av intresse.
Dessa protokoll kan användas för att kvantifiera förändringar i exosomal miRNA i patienter, modeller gnagare och cellodlingsmedia före och efter farmakologisk intervention. Exosomal innehåll varierar beroende på källan av ursprung och de fysiologiska tillstånd av celler som utsöndrar exosomes. Dessa variationer kan ge insikt om hur celler och system hantera stress eller fysiologiska störningar. Vår representativa data visar variations i miRNA närvarande i exosomes renade från mus blod, människoblod och mänskliga cellodling.
Här kommer vi att beskriva förfarandet för att kvantitativt analysera miRNA och budbärar-RNA (mRNA) från exosomes utsöndras i blodet och cellodling. Renade exosomes kommer att karaktäriseras med western blot-analys för exosomal markörer och PCR för mRNA av intresse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) och immunogold märkning kommer att användas för att validera exosomal morfologi och integritet. Total RNA kommer att renas från dessa exosomes för att säkerställa att vi kan studera både mRNA och miRNA från samma prov. Efter validering RNA integritet genom Bioanalyzer, kommer vi utföra ett medium genomströmning kvantitativ realtids PCR (qPCR) för att identifiera exosomal miRNA med Taqman Low Density Array (TLDA) kort och gen studier uttryck för utskrifter av intresse.
Dessa protokoll kan användas för att kvantifiera förändringar i exosomal miRNA in patienter, modeller gnagare och cellodlingsmedia före och efter farmakologisk behandling. Exosomal innehåll varierar beroende på källan av ursprung och de fysiologiska tillstånd av celler som utsöndrar exosomes. Dessa variationer kan ge insikt om hur celler och system hantera stress eller fysiologiska störningar. Vår representativa data visar variationer i miRNA närvarande i exosomes renade från mus blod, människoblod och mänskliga cellodling
Introduction
Korta noncoding miRNA modulera genuttryck genom bindning till mål-mRNA. Seed sekvenskomplementaritet av ~ 7 baspar gör miRNA att binda till mål-mRNA resulterar i hämning av översättning eller minskning av stabiliteten hos mRNA, som båda kan leda till minskat uttryck av målproteinet 1. Forskning under det senaste decenniet har entydigt visat en grundläggande roll för miRNA i att medla cellulära funktioner. Det har också skett en betydande ansträngning för dissekera miRNA medierade molekylära förändringar som ligger bakom olika sjukdomar 2,3. Dessutom banade nyligen identifiering av stabila miRNA i kroppsvätskor 4-6 vägen för deras användning som nya biomarkörer som lämpar sig för klinisk diagnos.
Ett läge av miRNA transporter i kroppsvätskor är via exosomes, små blåsor som bär mRNA, proteiner, medlare lipid och miRNA till recipientceller via systemiska blod cirkulerarion 7-14. Detta resulterar i modulering av genuttryck i mottagarceller och representerar en ny mekanism av cellulär kommunikation. Till exempel kan celler modulera immun-reglerande processer genom att utsöndra och / eller absorberande exosomer innehållande biomolekyler involverade i inflammation såsom interleukin-1β (IL1β), tumörnekrosfaktor-α (TNFa), transformerande tillväxtfaktor-β5 (TGFβ5), och de miRNA som reglerar dessa gener 13. Som avvikande miRNA uttryck är ett vanligt inslag i en mängd olika mänskliga sjukdomar, dessa molekyler ger nya spännande möjligheter för upptäckt och validering av nya terapeutiska mål 2.
Cirkulerande miRNA finns i alla kroppsvätskor och det är känt att sammansättningen av exosomer är olika baserat på källcellerna från vilka de släpptes. Alltså de erbjuder en väg att studera fysiologisk status av cellerna och hur cellerna alter signalerar ävents som svar på stress inklusive sjukdomar. Studera förändringar i exosome sammansättning kan ge insikt i signaltransduktion och undersöka deras potentiella användbarhet som biomarkörer eller terapeutiska vägar ingripande.
Här kommer vi att visa rening av exosomes från flera källor baserade på publicerade protokoll. Dessa exosomes kommer att användas för RNA isolering följt av qPCR att identifiera och mäta nivåerna av miRNA närvarande i exosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll, visar vi en kvantifiering av miRNA och mRNA från exosomer renade genom differentiell centrifugering från blod-och odlingsmedia. Exosomes har olika komponenter beroende på deras ursprung och är involverade i ett antal biologiska funktioner, inklusive immunförsvaret, antigen presentation, intracellulär kommunikation och överföring av RNA och proteiner 9,11,12,19,20. Medan storlek och form är en avgörande faktor för exosome renhet, ett antal artiklar som visar EM data exosomes indik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av medel från Rita Allen Foundation till Seena Ajit. Författarna vill tacka Erika Balogh och Dr Soumitra Ghoshroy från University of South Carolina elektronmikroskopi Center för instrumentets användning, vetenskapligt och tekniskt stöd.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
