Cell Co-cultuur Patterning gebruiken waterige tweefasensysteem Systems

Summary

Waterige tweefasensysteem systemen werden gebruikt om gelijktijdig meerdere patroon populaties van cellen. Deze snelle en gemakkelijke methode voor patroonvorming cel maakt gebruik van de fasenscheiding van waterige oplossingen van dextran en polyethyleenglycol en de grensvlakspanning die tussen de twee polymeeroplossingen.

Abstract

Cell patronen technologieën die snel, makkelijk te gebruiken en betaalbaar zal zijn voor de toekomstige ontwikkeling van high-throughput cel assays, platforms voor het bestuderen van cel-cel interacties en weefselmanipulatieproducten systemen. Deze gedetailleerde protocol beschrijft een werkwijze voor het co-kweken van cellen met biocompatibele oplossingen van dextran (DEX) en polyethyleenglycol (PEG) die fase-gescheiden combinatie boven de drempel concentraties. Cellen kunnen worden patroon in verschillende configuraties met deze methode. Cell uitsluiting patroon kan worden uitgevoerd door het afdrukken druppels DEX op een substraat en ze te bedekken met een oplossing van PEG bevattende cellen. De grensvlakspanning gevormd tussen de twee polymeeroplossingen veroorzaakt cellen vallen rond de buitenkant van de DEX druppel en een cirkelvormige clearing die voor migratie assays vormen. Cell eilanden kunnen patroon door het afgeven van een cellenrijke DEX fase in een PEG oplossing of door het bedekken van DEXdruppeltje met een oplossing van PEG. Co-culturen direct gevormd worden door het combineren van cel uitsluiting met DEX eiland patronen. Deze methoden zijn compatibel met verschillende liquid handling benaderingen, waaronder handmatige micropipetting, en kan worden gebruikt met vrijwel alle aanhangend celtype.

Introduction

Waterige tweefasensysteem systemen (ATPSs) vormen wanneer oplossingen van twee incompatibele polymeren worden gemengd in voldoende hoge concentraties. Fasescheiding wordt beïnvloed door een aantal factoren dat het molecuulgewicht en de polariteit van de polymeren, de temperatuur van de oplossingen, pH en ionische inhoud van het waterige oplosmiddel ^{1, 2} omvatten. Het punt waar de twee afzonderlijke polymeeroplossingen wordt bepaald door de fysisch-chemische eigenschappen van de gekozen fase systeem, maar gebeurt meestal bij lage polymeerconcentraties (minder dan 20% wt / wt) onder niet-denaturerende omstandigheden, waardoor ATPSs worden gebruikt voor biotechnologie toepassingen ^3-9.

Verreweg de meest uitgebreid bestudeerde ATPS is het polyethyleenglycol (PEG) / dextran (DEX) systeem. De ATPS gevormd door deze goedkoop en biocompatibele polymeren werd beschreven voor de zuivering van biomoleculen door middel van moleculaire verdeling ^{2, 10.} Partitionerenontstaat wanneer aanvullende moleculen of deeltjes die niet bijdragen aan het fasensysteem gemengd met PEG en DEX. Basis van hun relatieve affiniteiten voor zowel DEX of PEG, de moleculen of deeltjes bij voorkeur bevinden in een van de twee fasen of aan het grensvlak. Andere eigenschap van het PEG / DEX ATPS het bestaan ​​van grensvlakspanning tussen de twee fasen polymeer. ATPSs gevormd door PEG en DEX algemeen weergegeven grensvlak spanningen die veel lager zijn dan andere vloeistof-vloeistof tweefasen systemen zoals olie en water, maar de grensvlakspanning krachten nog effecten uitoefenen op kleine deeltjes zoals virussen, cellen en eiwitaggregaten ^{2 , 11-13.} Tot slot, aangezien hoger molecuulgewicht PEG en DEX gescheiden in lage concentraties (minder dan 5% wt / wt voor hoogmoleculaire polymeren soorten) in aanwezigheid van fysiologische zoutconcentraties, weinig of geen nadelige effecten op zoogdiercellen opgenomen in deze systemen^14-16.

Onlangs hebben de grensvlak eigenschappen en partitioneren effecten van ATPSs toegepast door ons lab voor cel patronen ^{14, 16-20.} Dit werd bereikt door een dichter micropatterning DEX oplossing op celculturen substraten in aanwezigheid van PEG. Wanneer cellen worden opgenomen in de PEG fase, worden ze niet deelnemen aan de DEX druppeltjes door PEG / DEX grensvlakspanning ^20. Wanneer cellen worden gevormd in de DEX fase zijn zij gehouden op het oppervlak van het substraat door celkweek grensvlakspanning en verdeling ^{16, 17, 19.}

In tegenstelling tot andere methoden voor cel patronen, ATPS cel patroon is eenvoudig te leren en vraagt ​​slechts rudimentaire kennis van de polymeren zelf, en de mogelijkheid om celkweek uitvoeren en een micropipettor. Andere methoden voor cel patronen vaak sprake van gespecialiseerde apparatuur en opleiding die niet eenvoudig kunnen worden vertaald naar ee life sciences. Bijvoorbeeld, sommige methoden (microcontact afdrukken of inkjet) patroon cellen indirect door toepassing van cel lijm patronen biomoleculen aan een cultuur substraat die vervolgens dienen als plaatsen voor celhechting ^{21, 22.} Hoewel indirect benaderingen zijn bruikbaar voor sommige celtypen, ze vereisen een hoge graad van vaardigheid en user gespecialiseerde apparatuur voor de patroon gereedschap fabriceren en kunnen missen specificiteit afhankelijk van de specifieke celtype / biomolecule patroon. Als alternatief kunnen cellen worden gedeponeerd bij een hoge specificiteit patroon door middel van een directe patronen benaderingen die laminaire stroming patronen, sjabloneren en inkjet printing ^23-26 op te nemen. Deze technieken zijn echter ook gebruiker vereist deskundigheid en gespecialiseerde apparatuur en kunnen cellen beschadigen tijdens het drukproces. Hoewel deze benaderingen produceren in het algemeen nauwkeurige patronen van cellen, voor cel patronen een nuttig instrument in de life sciences zijn, moet het rendabel zijn eennd eenvoudig te implementeren.

Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van een patroon celculturen met behulp van de ATPSs beschreven in ons eerder gepubliceerde aanvragen. Met alleen micropipettors, kunnen gebruikers cel uitsluiting zones of cel eilanden voor migratie assays. Dit wordt bereikt door middel van PEG / DEX grensvlakspanning die ofwel cellen behouden in de DEX fase of uitsluit cellen gedeponeerd in de PEG fase van DEX. Door kammen deze twee fundamentele patronen technieken is het mogelijk om spoedig co-celkweken zoals lever-fibroblast cell co-culturen. Patronen methoden, ATPS parameters en verwachte resultaten worden beschreven in detail.

Protocol

1. Fase Systeem Karakterisering: Het bepalen van Drempels voor fasescheiding Bereid oplossingen die PEG en DEX in de gewenste buffer of celkweekmedium zoals getoond in Figuur 1 (paarse stippen) in 15 ml of 50 ml conische buizen. Hierna zal PEG en DEX zie 35 kDa PEG en 500 kDa DEX, maar kritische concentraties verandert afhankelijk van de gebruikte twee polymeren. Noteer de massa van PEG en DEX in elke oplossing. Hoge concentratie polymeer oplossingen kan enkele uren duren om op te lossen. Vor…

Representative Results

Het selecteren van een geschikte combinatie van PEG en DEX voor cel patroon is belangrijk om de binodaal curve. Deze curve schetst de punten waar een ATPS kan vormen en kan variëren voor een gegeven set van polymeren op basis van temperatuur, pH en ionische inhoud. Voor het kweken van cellen die aangepast medium formuleringen nodig kan het nodig om experimenteel bepalen binodaal curve. Dit wordt bereikt door het genereren van een reeks ATPSs die ver van de binodaal en variërend in de PEG en DEX inhoud (figuur …

Discussion

De ATPS cel micropatterning methode vereist zeer weinig expertise buiten vaardigheid in celkweek technieken en kan snel worden beheerst. De voordelen van deze benadering zijn dat het goedkoop, snel en compatibel met verschillende celtypes en cultuur formaten. Om deze redenen moeten ons protocol gemakkelijk worden overgenomen door het leven wetenschappers, met name degenen die een studie cel proliferatie, migratie en chemotaxis, en de invloed van juxtacrine en paracriene interacties tussen celpopulaties. De assays hier g…

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA