דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Summary

מערכות מימיות שני שלבים שמשו בו זמנית לאוכלוסיות רבות הדפוס של תאים. השיטה מהירה וקלה זה עבור דפוסי תא מנצלת את הפרדת פאזות של תמיסות מימיות של גליקול dextran ופוליאתילן ומתח interfacial שקיים בין שני פתרוני הפולימרים.

Abstract

טכנולוגיות דפוסים סלולריים, כי הם מהירים, קלים לשימוש ובמחיר סבירים שתידרשנה לפיתוח העתידי של מבחני תפוקה גבוהות סלולריים, פלטפורמות לחקר אינטראקציות תא סלולריים ומערכות רקמות מהונדסות. פרוטוקול מפורט זה מתאר שיטה ליצירת שיתוף תרביות של תאים באמצעות פתרונות ביולוגיים של dextran (DEX) ופוליאתילן גליקול (PEG) ששלב נפרד בשילוב ריכוזים מעל סף. תאים יכולים להיות תבנית במגוון תצורות המשתמשות בשיטה זו. דפוסי הדרת תא יכולים להתבצע על ידי הדפסת טיפין של DEX על מצע ומכסה אותם עם תמיסה של תאים המכיל PEG. מתח interfacial נוצר בין שני פתרוני הפולימר גורם לתאים לנפול סביב החלק החיצוני של טיפת DEX וליצור קרחת עגולה שיכול לשמש למבחני הגירה. איים סלולריים יכולים להיות תבנית על ידי מחלק שלב DEX תא עשיר לפתרון PEG או על ידי כיסוי DEXאגל עם פתרון של PEG. עמיתים לתרבויות יכולות להיוצר באופן ישיר על ידי שילוב של הדרת תא עם דפוסי האי DEX. שיטות אלה הן תואמות עם מגוון רחב של גישות טיפול נוזל, כולל micropipetting הידני, וניתן להשתמש בו עם כמעט כל סוג תא חסיד.

Introduction

מערכות של שתי שכבות מימיות (ATPSs) טופס כאשר פתרונות של שני פולימרים אינם תואמים מעורבבים בריכוזים גבוהים מספיק. הפרדת שלב מושפע ממגוון של גורמים, הכוללים את המשקל המולקולרי וקוטביות של הפולימרים, הטמפרטורה של הפתרונים, pH והתוכן יוני של ¹ הממס ^{המימי, 2.} הנקודה שבה שני פתרוני הפולימר הנפרדים נקבעים על ידי מאפייני physiochemical של מערכת השלב נבחר, אך בדרך כלל מתרחשת בריכוזי פולימר נמוכים (פחות מ 20% wt / wt) תחת הלא denaturing תנאים, המאפשרת ATPSs לשמש לביוטכנולוגיה יישומים ^3-9.

עד כה, ATPS הנחקר ביותר בהרחבה היא מערכת dextran (DEX) פוליאתילן גליקול (PEG) /. את ATPS נוצר על ידי פולימרים זולים וביולוגיים אלה תואר במקור עבור הטיהור של ביומולקולות בדרך של חלוקה מולקולרית ^{2, 10.} מחיצותמתרחש כאשר מולקולות נוספות או חלקיקים שאינם תורמים למערכת השלב מעורבבות עם PEG ו DEX. בהתבסס על הזיקות היחסיות שלהם לאו DEX או PEG, המולקולות או חלקיקים תהיינה מועדפות מתגוררות בתוך אחד משני השלבים או בממשק. מאפיין נוסף של PEG / DEX ATPS הוא קיומו של מתח interfacial בין שני שלבי הפולימרים. ATPSs נוצר על ידי PEG ו DEX בדרך כלל להציג מתחי interfacial כי הם נמוכים בהרבה ממערכות נוזל נוזל אחרות שני שלבים כמו שמן ומים, אולם כוחות מתח interfacial עדיין השפעות על חלקיקים קטנים כגון וירוסים, תאים ואגרגטים חלבון ^{2 , 11-13.} לבסוף, מאחר שמשקל המולקולרי הגבוה וPEG DEX הנפרד בריכוזים נמוכים (wt / wt לזני פולימרי משקל מולקולריים גבוהים פחות מ 5%) בנוכחות ריכוזים פיסיולוגיים של מלחים, יש כמה, אם בכלל, השפעות מזיקות על תאי יונקים שולבו בתוך אלה מערכות^14-16.

לאחרונה, את מאפייני interfacial ואפקטי חלוקת ATPSs יושמו על ידי המעבדה שלנו עבור דפוסי תא ^{14, 16-20.} זו הושגה פתרון DEX צפוף על מצעי תרביות תאים בנוכחות PEG ידי micropatterning. כאשר תאים שולבו שלב PEG, הם מנועים מלהיכנס לטיפי דקס עקב מתח interfacial PEG / DEX ^20. כאשר תאים הם בדוגמת בשלב DEX, הן נשמרות על פני השטח של מצע תרבית התאים במתח ובמחיצות ^{16, 17, 19} interfacial.

בניגוד לשיטות אחרות לדפוסי תא, תא דפוסי ATPS קלים ללימוד ודורשים ידע בסיסי על הפולימרים עצמם, והיכולת לבצע תרבית תאים ולהשתמש micropipettor בלבד. שיטות אחרות לדפוסי תא כרוך לעתים קרובות בציוד והכשרה מיוחדים שאינם מתורגמים בקלות לדואר מדעי חיים. לדוגמה, כמה שיטות (microcontact הדפסת הדפסה או הזרקת דיו) תאי דפוס בעקיפין על ידי יישום דפוסים של ביומולקולות הדבקה הסלולרית למצע תרבות שלאחר מכן ישמשו כאתרים לקובץ מצורף תא ^{21, 22.} למרות גישות עקיפות שימושיות לכמה סוגי תאים, הם דורשים רמה גבוהה של מיומנות משתמש וציוד מיוחד כדי להמציא כלי הדפוסים, ויכולים חסרי ייחוד בהתאם לסוג הדפוס / biomolecule המסוים של התאים. לחלופין, ניתן להפקיד תאים עם סגוליות דפוס גבוהות בדרך של גישות דפוסים ישירים הכוללות מינרית זרימת דפוסים, שכפול והדפסת דיו ^23-26. עם זאת, שיטות אלו דורשות גם מומחיות משתמש וציוד מיוחד, ויכולות לפגוע בתאים בתהליך ההדפסה. למרות שגישות אלו בדרך כלל לייצר דפוסים מדויקים של תאים, לדפוסי תא להיות כלי שימושי בתחום מדעי החיים, זה חייב להיות חסכוניnd פשוט ליישום.

כאן אנו מדווחים פרוטוקול מפורט ליצירת תרביות תאים בדוגמת באמצעות ATPSs המתואר ביישומים שלנו שפורסמו בעבר. שימוש micropipettors בלבד, משתמשים יכולים ליצור אזורים סלולריים הדרה או איים סלולריים עבור מבחני הגירה. זו מושגת בדרך של מתח interfacial PEG / DEX כי גם שומר תאים בשלב DEX או מוציא תאים הופקדו בשלב PEG מDEX. על ידי סריקת שתי טכניקות דפוסי יסוד אלה, ניתן במהירות כדי לייצר עמיתים לתרביות של תאים כמו תאי כבד פיברובלסטים שיתוף תרבויות. שיטות דפוסים, פרמטרי ATPS ותוצאות צפויות מתוארות בפירוט.

Protocol

1. אפיון מערכת שלב: ספים הקובע להפרדת שלב הכן את פתרונות המכילים PEG ו DEX במאגר הרצוי או בינוני תרבית תאים כפי שמוצגים באיור 1 (נקודות סגולות) ב15 מ"ל או 50 צינורות חרוטי מ"ל. להלן, PEG ו DEX יתייחסו לPEG 35 kDa ו 500 דקס kDa…

Representative Results

כדי לבחור שילוב מתאים של PEG ו DEX עבור דפוסי תא זה חשוב כדי לקבוע את עקומת binodal. עקומה זו משרטטת את הנקודות בן כ ATPS יכול להיוצר ויכול להשתנות לקבוצת נתונה של פולימרים המבוססות על הטמפרטורה, pH ותוכן יוני. לתאי culturing שדורשים ניסוחים בינוניים אישית ייתכן שיהיה צורך בניסוי כד…

Discussion

שיטת micropatterning תא ATPS דורשת מומחיות מעט מאוד מעבר למיומנות בטכניקות תרביות תאים וניתן לשלוט במהירות. היתרונות של גישה זו הם שהוא זול, מהיר ותואם עם מגוון רחב של סוגי תאים ותבניות תרבות. מסיבות אלה, הפרוטוקול שלנו יש לאמץ בקלות על ידי מדעני חיים, במיוחד אלה שלומדים התפשטו…

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA