Cell Co-kultur Mønster med vandig tofasesystemer

Summary

Vandige tofasesystemer ble brukt til samtidig mønster flere populasjoner av celler. Denne raske og enkel metode for celle mønster utnytter faseseparasjon av vandige oppløsninger av dekstran og polyetylenglykol og grenseflatespenningen som eksisterer mellom de to polymer-løsninger.

Abstract

Cell mønster teknologier som er rask, enkel å bruke og rimelig vil være nødvendig for den fremtidige utviklingen av høy gjennomstrømning celle-analyser, plattformer for å studere celle-celle interaksjoner og vev konstruerte systemer. Denne detaljerte protokollen beskriver en fremgangsmåte for generering av co-kulturer av celler ved hjelp av oppløsninger av biokompatible dekstran (DEX) og polyetylenglykol (PEG) som fase-separat når kombinert ovenfor terskelkonsentrasjon. Celler kan mønstret i en rekke konfigurasjoner med denne metoden. Cell uttrekk mønster kan utføres ved å skrive dråper av DEX på et substrat og dekker dem med en oppløsning av PEG som inneholder celler. Grenseflatespenningen dannet mellom to polymer-løsninger forårsaker celler å falle rundt utsiden av DEX dråpene og danner en sirkulær clearing som kan brukes for migrasjon analyser. Cell øyer kan mønstret ved å dispensere en celle-rik DEX fase inn en PEG løsning eller ved å dekke DEXDroplet med en oppløsning av PEG. Co-kulturer kan dannes direkte ved å kombinere celle eksklusjon med DEX øya mønster. Disse metodene er kompatible med en rekke væskehåndtering tilnærminger, inkludert manuell micropipetting, og kan brukes med praktisk talt alle vedheftende celletype.

Introduction

Vandige tofasesystemer (ATPSs) form når oppløsninger av to uforenlige polymerer er blandet sammen ved høye nok konsentrasjoner. Faseatskillelse påvirkes av en rekke faktorer som inkluderer molekylvekten og polaritet av polymerene, Oppløsningenes temperatur, pH og ionisk innholdet av den vandige ^{1 oppløsningsmiddel, 2.} Punktet der de to polymerløsninger separate bestemmes av fysiokjemiske egenskaper av den valgte fase system, men vanligvis skjer ved lave polymer konsentrasjoner (mindre enn 20% vekt / vekt) under ikke-denaturerende betingelser, slik ATPSs skal brukes for bioteknologi applikasjoner ^3-9.

Langt den mest omfattende studert ATPS er polyetylenglykol (PEG) / dekstran (DEX) system. De ATPS dannet av disse billig og biokompatible polymerer ble opprinnelig beskrevet for rensing av biomolekyler ved hjelp av molekylær partisjonering ^{2, 10.} Partisjoneringoppstår når ytterligere molekyler eller partikler som ikke bidrar til fase systemet er blandet med PEG og DEX. Basert på deres relative affiniteter for enten DEX eller PEG, vil molekyler eller partikler fortrinnsvis bor innenfor en av de to faser eller på grensesnittet. En annen egenskap ved PEG / DEX ATPS er eksistensen av grenseflatespenning mellom de to polymer faser. ATPSs dannet av PEG og DEX generelt vise grenseflatesoner spenninger som er mye lavere enn andre væske-væske tofasesystem som olje og vann, men de grenseflatespenningen strekkreftene fortsatt utøve effekter på små partikler som for eksempel virus, celler og protein aggregater ^{2 , 11-13.} Til slutt, siden høyere molekylvekt PEG og DEX separat ved lave konsentrasjoner (mindre enn 5% vekt / vekt for høymolekylære polymerer varianter) i nærvær av fysiologiske konsentrasjoner av salter, er det få eller ingen skadelige effekter på pattedyrceller innarbeidet i disse systemer^14-16.

Nylig har de grenseflatespenningen egenskaper og partisjonering effekter av ATPSs blitt brukt av vårt laboratorium for celle mønster ^{14, 16-20.} Dette ble oppnådd ved micropatterning en tettere DEX løsning på cellekultur substrater i nærvær av PEG. Når celler blir innlemmet i PEG fasen, de utelukkes fra å komme inn DEX dråpene grunnet PEG / DEX fasegrensespenningen ^20. Når celler blir mønstret i DEX fasen blir de fastholdt i overflaten av cellekultur substratet ved fasegrensespenningen og partisjonering ^{16, 17, 19.}

I motsetning til andre metoder for celle mønster, er ATPS celle mønster lett å lære og krever bare rudimentær kunnskap om polymerer selv, og muligheten til å utføre cellekultur og bruke en micropipettor. Andre metoder for celle mønster ofte innebære spesialisert utstyr og opplæring som ikke er lett oversettes til the biovitenskap. For eksempel har noen metoder (microcontact utskrift eller blekkutskrifter) mønster celler indirekte ved å bruke mønstre av celle lim biomolekyler til en kultur substrat som senere tjene som områder for celleadhesjon ^{21, 22.} Selv indirekte tilnærminger er nyttige for enkelte celletyper, krever de en høy grad av dyktighet og brukerens spesialisert utstyr for å fabrikkere den mønster-verktøyet, og kan mangle spesifisitet avhengig bestemt celletype / biomolekyl mønster. Alternativt, kan cellene deponeres med høy mønster spesifisitet ved hjelp av direkte mønster tilnærminger som inkluderer laminær mønster, stenciling og blekkutskrifter ^23-26. Men disse teknikkene krever også bruker kunnskap og spesialutstyr, og kan skade celler under trykkeprosessen. Selv om disse metodene generelt produsere presise mønstre av celler, for celle mønster til å være et nyttig verktøy i life science, må det være kostnadseffektivt ennd enkel å implementere.

Her rapporterer vi en detaljert protokoll for å generere mønstret cellekulturer ved hjelp av ATPSs beskrevet i våre tidligere publiserte applikasjoner. Med bare micropipettors, kan brukerne lage celle eksklusjon soner eller celle øyer for migrasjon analyser. Dette oppnås ved hjelp av PEG / DEX fasegrensespenningen som enten beholder cellene i DEX fase eller utelukker celler avsatt i PEG fase fra DEX. Ved å kombinere disse to grunnleggende mønster teknikker, er det mulig å raskt generere co-kulturer av celler som for eksempel lever-fibroblast celle co-kulturer. Mønster metoder, ATPS parametere og forventede resultater er beskrevet i detalj.

Protocol

1. Fase System karakterisering: Bestemme Grenser for faseseparasjon Forbered løsninger inneholdende PEG og DEX i ønsket buffer eller cellekulturmedium som vist i figur 1 (lilla prikker) i 15 ml eller 50 ml koniske rør. Heretter vil PEG og DEX referere til 35 kD PEG og 500 kDa DEX, men vil kritiske konsentrasjoner endres avhengig av to polymerer som brukes. Registrere massen av PEG og DEX i hver løsning. Høy konsentrasjon polymerløsninger kan ta flere timer å oppløse. Virvling kan bruk…

Representative Results

Å velge en passende kombinasjon av PEG og DEX for celle mønster er det viktig å bestemme binodal kurven. Denne kurven delineates de punkter hvor en ATPS kan form og kan variere for et gitt sett av polymerer basert på temperatur, pH og ionisk innhold. For dyrking celler som krever tilpassede medium formuleringer kan det være nødvendig for å eksperimentelt bestemme binodal kurve. Dette oppnås ved å generere en serie av ATPSs som er langt fra den binodal og varierende i deres PEG og DEX innholdet (Figur 1,…

Discussion

Den ATPS celle micropatterning metoden krever svært lite kompetanse utover ferdigheter i cellekultur teknikker og kan raskt mestret. Fordelene med denne fremgangsmåten er at det er billig, hurtig og er kompatibel med en rekke celletyper og kultur formater. Av disse grunner, bør vår protokoll lett vedtatt av livet forskere, spesielt de som studerer celle proliferasjon, migrasjon og chemotaxis, og påvirkning av juxtacrine og parakrine samspill mellom celle populasjoner. Analysene som presenteres her kan lett kvantifi…

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA