Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme
Summary
Sulu de iki fazlı sistemlerde hücrelerin aynı anda birden fazla kalıp popülasyonları için kullanılmıştır. Hücre desenlendirme için bu hızlı ve kolay bir yöntem dekstran ve polietilen glikol ve iki polimer çözümleri arasında var arayüzey gerilimi sulu çözeltilerinin faz ayrışması yararlanır.
Abstract
Hızlı, kullanımı kolay ve uygun fiyatlı Hücre desenlendirme teknolojileri hücre-hücre etkileşimleri ve doku mühendislik sistemlerini incelemek için yüksek verimlilik hücresi tayinlerinde, platformların gelecekteki gelişimi için gerekli olacaktır. Bu ayrıntılı protokol eşik konsantrasyonu yukarıda kombine faz ayrı zaman ki dekstran (DEX) ve polietilen glikol (PEG) solüsyonları kullanılarak biyo-uyumlu hücre eş-kültür üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Hücreler bu yöntem kullanılarak çeşitli konfigürasyonlarda da desenli olabilir. Hücre dışlama modelleme bir alt tabaka üzerinde damlacıkların DEX baskı ve PEG içeren bir hücre, bir solüsyon ile kaplanması ile uygulanabilir. İki polimer çözeltileri arasında oluşan ara yüzey gerilimi DEX damlacık dış çevresinde düşme ve geçiş deneyleri için kullanılan bir dairesel açıklığa oluşturmak için hücreler neden olur. Hücre adalar PEG çözeltisi içine hücreden zengin DEX fazlı dağıtım veya DEX örterek desenli olabilirPEG çözeltisi ile damlacık. Eş-kültür DEX ada modelleme ile hücre çıkarma birleştirilmesi ile direkt olarak oluşturulabilir. Bu yöntemler, manuel micropipetting içeren sıvı işleme yaklaşımı, bir dizi ile uyumlu olan, ve hemen hemen herhangi bir yapışkan ile hücre tipi kullanılabilir.
Introduction
Iki uyuşmayan polimerlerin çözeltileri yeterince yüksek konsantrasyonlarda karıştırılır Sulu iki fazlı sistemler (ATPSs) oluşturur. Faz ayırma molekül ağırlığı ve polarite polimerlerin, çözeltiler, pH ve sulu çözücü 1, 2, iyonik içeriğinin ısısı içeren çeşitli faktörler tarafından etkilenmektedir. Ayrı iki polimer çözeltileri seçilmiş fazlı bir sistemin fizyokimyasal özellikler ile belirlenmiştir, fakat hangi nokta genellikle ATPSs biyoteknolojide kullanılan izin vererek, denatüre edici olmayan koşullar altında düşük bir polimer konsantrasyonu (% 20 den az ağırlık / ağırlık) gerçekleşir uygulamalar 3-9.
Bugüne kadar en çok çalışılan ATP polietilen glikol (PEG) / dekstran (DEX) sistemidir. Bu pahalı olmayan ve biyolojik olarak uyumlu polimerler ile oluşturduğu ATP aslen moleküler bölümleme 2, 10 yolu ile biyomoleküllerin arıtma için tarif edilmiştir. Bölümlemefazlı sistemde katkıda olmayan ek moleküllerin veya parçacıkların PEG ve DEX ile karışık oluşur. DEX veya PEG ya da onların ilgili yakınlığa göre, moleküller veya parçacıklar tercihen iki faz biri içinde ya da ara yüzeyde yer alacaktır. PEG / DEX ATP diğer bir özelliği iki polimer fazlar arasındaki arayüzey gerilimi varlığıdır. PEG ve DEX oluşturduğu ATPSs genellikle yağ ve su gibi diğer sıvı-sıvı iki fazlı sistemlerde çok daha düşüktür arayüzey gerilimleri görüntüleyebilir, ancak arayüzey gerilimi kuvvetler hala, virüsler, hücre ve protein agrega 2 gibi küçük parçacıklar üzerinde etkileri bulunmaktadır , 11-13. Memeli hücreleri üzerinde herhangi bir zararlı etkilerini bu sahasına dahil Son olarak, yüksek bir moleküler ağırlık PEG ve DEX tuzlarının fizyolojik konsantrasyonlarının varlığında, düşük konsantrasyonlarda (% 5'inden az ağ / yüksek moleküler ağırlıklı polimerler çeşitleri için ağırlık) olarak ayrı bir yana, azdır sistemleri14-16.
Son zamanlarda, arayüzey özellikleri ve ATPSs bölümleme etkileri hücre desenlendirme 14, 16-20 için laboratuvar tarafından uygulanmıştır. Bu micropatterning, PEG varlığında, hücre kültürü yüzeyler üzerinde daha yoğun bir DEX çözelti gerçekleştirildi. Hücrelerin PEG fazına dahil edildiğinde, PEG / DEX arayüzey gerilimi 20 nedeniyle DEX damlacıkları girdikten dışındadır. Hücreler DEX faz olarak desenli, bunlar ara yüzey gerilimi ve bölümleme 16, 17, 19 ile hücre kültür substrat yüzeyine tutulur.
Hücre desenlendirme için diğer yöntemlerden farklı olarak, ATP hücre desenlendirme öğrenmesi kolay ve sadece polimerler kendilerini ve hücre kültürü gerçekleştirmek ve bir mikropipet kullanma yeteneği hakkında temel bilgi gerektirir. Hücre desenlendirme için diğer yöntemler genellikle kolayca inci tercüme edilmediyse özel ekipman ve eğitim gerektirire yaşam bilimleri. Örneğin, bazı yöntemler (mikrokontak baskı veya mürekkep püskürtmeli baskı) dolaylı sonradan hücre eki 21, 22 siteler olarak hizmet kültürü substrat hücre yapışkan biyomoleküllerin desenler uygulayarak desen hücreleri. Dolaylı yaklaşım, bazı hücre türleri için yararlı olmalarına rağmen, kullanıcı beceri ve modelleme araç imal etmek için özel ekipman yüksek derecede gerektirir, ve belirli hücre tipi / biyomolekül desenine bağlı olarak seçicilik eksikliği olabilir. Alternatif olarak, hücre laminer akış desenlendirme, neticede ve inkjet baskı 23-26 içeren doğrudan desenlendirme yaklaşımlar yoluyla yüksek desen özgüllük tevdi edilebilir. Ancak, bu teknikler aynı zamanda kullanıcı uzmanlık ve özel ekipman gerektiren ve yazdırma işlemi sırasında hücreler zarar verebilir. Bu yaklaşımlar genellikle yaşam bilimleri yararlı bir araç olarak hücre desenlendirme için hücreler, hassas desenleri üretmek olsa da, maliyeti etkili olmalıuygulamak basit nd.
Burada, daha önce yayınlanmış başvurular içerisinde açıklanmaktadır ATPSs kullanılarak desenli bir hücre kültürü üretmek için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Sadece Mikropipetler kullanarak, kullanıcılar göç deneyleri için hücre dışlama bölgeler veya hücre adaları üretebilir. Bu, ya DEX fazındaki hücrelerin korur veya DEX dan PEG faz içinde depolanmıştır hücreleri hariç PEG / DEX ara yüzey gerilimi yolu ile elde edilir. Bu iki temel modelleme teknikleri tarama olarak, bu hızla, karaciğer-fibroblast hücre ko-kültürler olarak hücrelerinin ko-kültürü üretmek mümkündür. Modelleme yöntemleri, ATP parametreleri ve beklenen sonuçlara ayrıntılı olarak tarif edilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATP hücre micropatterning yöntemi hücre kültürü teknikleri yeterlik ötesinde çok az uzmanlık gerektiren ve hızlı bir şekilde hakim olabilir. Bu yaklaşımın avantajı, ucuz ve hızlı hücre kültürü türleri ve çeşitli biçimlerde ile uyumlu olmasıdır. Bu nedenlerden dolayı, bizim protokol kolayca özellikle yaşam bilim adamları, hücre çoğalması, göç ve kemotaksis, ve hücre popülasyonları arasındaki juxtacrine ve parakrin etkileşim etkisini araştıran kişiler tarafından kabul edilmel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JBW için:; Bu çalışma Coulter Vakfı, Beyster Vakfı, Lisansta Araştırma Fırsat (UROP) ATA ve Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu (2010101926. Kimlik Hibe hiçbir DGE 0718128) için yaz programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagent | Manufacturer |
| Dextran 500,000 kDa | Pharmacosmos, Denmark |
| Polyethylene Glycol 35,000 kDa | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO |
| Hela | ATCC, Manassas, VA |
| HepG2 C3A | ATCC, Manassas, VA |
| NIH 3T3 | ATCC, Manassas, VA |
| Cell Tracker | Invitrogen, Carlsbad, CA |
| DMEM | Gibco, Carlsbad, CA |
| RPMI | Gibco, Carlsbad, CA |
| F12 | Gibco, Carlsbad, CA |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Carlsbad, CA |
References
- Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems : methods and protocols. Methods in biotechnology. xiii, 440 (2000).
- Albertsson, P. A. k. . Partition of cell particles and macromolecules: separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes, and cells in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. , 346 (1986).
- Yamada, M., et al. Continuous cell partitioning using an aqueous two-phase flow system in microfluidic devices. Biotechnol. Bioeng. 88 (4), 489-494 (2004).
- Soohoo, J. R., Walker, G. M. Microfluidic aqueous two phase system for leukocyte concentration from whole blood. Biomed. Microdevices. 11 (2), 323-329 (2009).
- Hahn, T., Hardt, S. Concentration and size separation of DNA samples at liquid-liquid interfaces. Anal. Chem. 83 (14), 5476-5479 (2011).
- Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems. A general overview. Mol. Biotechnol. 19 (3), 269-277 (2001).
- Hustedt, H., Kroner, K. H., Menge, U., Kula, M. -. R. Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology. 3 (6), 139-144 (1985).
- Keating, C. D. Aqueous Phase Separation as a Possible Route to Compartmentalization of Biological Molecules. Acc Chem. Res. 45 (12), 2114-2124 (2012).
- Helfrich, M. R., et al. Partitioning and assembly of metal particles and their bioconjugates in aqueous two-phase systems. Langmuir. 21 (18), 8478-8486 (2005).
- Diamond, A. D., Hsu, J. T. Prote. Partitioning in PEG/Dextran Aqueous Two-Phase Systems. AIChE Journal. 36 (7), 1017-1024 (1990).
- Y-T, Z. -. Q., Zhu, Modeling of interfacial tension of aqueous two-phase systems. Chemical Engineering Science. 54 (4), 433-440 (1999).
- Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Concentration dependence of the interfacial tension for aqueous two-phase polymer solutions of dextran and polyethylene glycol. Langmuir. 28 (8), 3831-3839 (2012).
- Rha, C. Interfacial Tension of Polyethylene Glycol/Potassium Phosphate Aqueous Two-Phase Systems. Physics and Chemistry of Liquids: An International Journal. 38 (1), 25-34 (2000).
- Fang, Y., et al. Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous Two-Phase Exclusion Patterning. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (9), 647-657 (2012).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8 (9), 736-741 (2009).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22 (24), 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., et al. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. , (2011).
- Tavana, H., Takayama, S. Aqueous biphasic microprinting approach to tissue engineering. Biomicrofluidics. 5 (1), 13404 (2011).
- Frampton, J. P., et al. Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems. Biomed. Microdevices. 13 (6), 1043-1051 (2011).
- Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Rehydration of Polymeric, Aqueous, Biphasic System Facilitates High Throughput Cell Exclusion Patterning for Cell Migration Studies. Advanced Functional Materials. 21 (15), 2920-2926 (2011).
- Falconnet, D., et al. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Eng. 13 (8), 1879-1891 (2007).
- Ringeisen, B. R., et al. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1 (9), 930-948 (2006).
- Wright, D., et al. Generation of static and dynamic patterned co-cultures using microfabricated parylene-C stencils. Lab Chip. 7 (10), 1272-1279 (2007).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Berthier, E., et al. Pipette-friendly laminar flow patterning for cell-based assays. Lab Chip. 11 (12), 2060-2065 (2011).
- Davidson, R. L., O’Malley, K. A., Wheeler, T. B. Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: effect of polyethylene glycol molecular weight and concentration. Somatic Cell Genet. 2 (3), 271-280 (1976).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Moon, S., Lin, P., Keles, H. O., Yoo, S., Demirci, U. Title Cell Encapsulation by Droplets. J. Vis. Exp. (8), e316 (2007).
