利用果蝇幼虫腹神经索,调查中枢神经系统的再生和修复受伤的范例。刺伤使用激光扫描共聚焦显微镜时间推移和固定的标本,有目的地开发的软件和遗传学与定量分析相结合,其次是中枢神经系统的再生和修复的分子机制。
已开发的实验方法,调查的细胞反应,中枢神经系统(CNS)损伤使用果蝇果蝇 。了解修复和再生的动物在生物学中是一个关键问题。人类中枢神经系统受损,无法再生,并了解如何推动再生医疗神经科学的主要目标之一。 果蝇强大的遗传工具包可以用来解决这个问题的中枢神经再生。
至CNS腹神经索(VNC,相当于脊椎动物脊髓)的病变施加手动用钨针。随后,VNC可以被使用激光扫描共聚焦显微镜拍摄的时间推移到24小时,顺应时代发展的病变随着时间的推移。另外,它可以进行培养,然后用免疫荧光可视化神经元和神经胶质细胞,激光共聚焦显微镜进行固定和染色。使用适当的标记,查的NGES在细胞形态和细胞状态造成的伤害可以可视化。 ImageJ的和故意的插件,定量和统计分析,可以进行测量伤口大小的变化,随着时间的推移和损伤的细胞增殖和细胞死亡的影响。这些方法可以让大样本量分析。他们可以结合强大的果蝇遗传学调查中枢神经系统的再生和修复的分子机制。
在动物中的再生揭示细胞感受到有机体生长时是有序的和完整的,并且是一个生物体的结构完整性如何实现和维持。了解这些神秘的能力的细胞是生物学中的极大兴趣。促进再生医疗神经科学的主要目标之一。在人类中,损坏的中枢神经系统(CNS)不会再生。脊髓损伤的啮齿类动物模型,了解细胞如何响应受伤。然而,伦理问题,成本高,生命周期慢的动物制约进展。
果蝇, 果蝇是一种广泛使用的模式生物发育生物学和神经科学。由于其强大的遗传工具和生命周期短,循环导致果蝇基因功能的发现和了解人类与疾病相关的基因网络。有大量的证据进化CON从果蝇到人类基因功能的守恒。
近年来,在果蝇神经系统损伤已经建立了几个范例。一些损害周围神经沿机翼或外周神经切断后,包括感觉和运动神经元轴突2。然而,在许多方面不同的外周和中枢神经系统,这是众所周知的,在许多动物外周神经系统,而中枢神经系统不能再生。因此,了解中枢神经系统的再生,直接伤害到中枢神经系统是比较合适的。用针的刺伤害已成功地应用于果蝇成人的大脑调查的3,4受伤的。使用另一种方法,阿亚兹等。切断中枢神经系统轴突在培养成人的大脑一个压电电源microdissector,并分析了它们的再生4天5。这些后来的实验集合U的优势ps的是,他们对大脑的重点,这无疑是极大的兴趣。它的缺点是,大脑是比VNC,其中仅涉及电机和传感控制复杂得多。成人的大脑也耗费更多的时间。幼虫准备在4天的实验,而大约需要10天,成虫羽化,然后额外的5天为他们的成熟。成人的大脑也更难以处理,因为它是包裹在厚厚的角质层,这是难以去除的。 VNC具有进一步吸引脊椎动物的脊髓功能等效。
被广泛使用6-9神经科学作为一种模式生物果蝇的幼虫。虽然严格来说是处于发展阶段的幼虫,它也可以被认为是一个全功能的动物。幼虫的运动,包括嗅觉,味觉和痛,以及学习和记忆的多种感官。因此,幼虫VNC瓦特选择的中枢神经系统损伤的理想模型。
解剖和培养幼虫和蛹VNCs可以在盘中,长达24小时10仍然保持细胞的完整性。这表明该损伤可施加到VNC,然后可以被记录在时间推移在此期间的时间,或培养并固定在任何期望的时间点在此期间之内。
在这里,我们提出了一个实验范式的中枢神经系统损伤的果蝇幼虫VNC。 VNC是第一次解剖的幼虫,,手工钨针,刺向损伤。 VNC是放在玻璃底的盖玻片,和时间的推移激光扫描共聚焦显微镜拍摄的。或者,VNCs可以为所希望的一段时间内进行培养,和损伤的细胞的影响,可以使用免疫染色和共聚焦显微镜的固定标本分析。伤口区域可以被测量,和定量分析细胞怒江人數(细胞增殖和细胞死亡),可以进行与有意开发软件。可以很容易地处理大样本的大小,在统计学上验证的结果。这些方法已成功地结合强大的果蝇的遗传学发现了一个基因网络的基础胶质细胞的再生反应中枢神经系统损伤11。
我们已经建立了一个协议刺伤的果蝇幼虫中枢神经系统损伤调查的细胞损伤,修复和再生。幼虫VNCs解剖和刺伤后,他们拍摄时间推移显微镜或荧光染色固定可视化神经胶质细胞和神经元,细胞凋亡或细胞分裂。随着时间的推移的病变的进展可以被测量。此方法的陪同下特意开发的软件的伤害,并在维修过程中的细胞数量变化对定量和统计分析。
我们被刺前96小时的机场快线的幼虫(和这些固定或进一步发展),发展阶段过渡到蛹和成虫。在96小时,VNCs有足够大的刺伤,它们是在中间的第三龄期的,并且从而不进行化蛹尚未;及神经系统已经是全功能的类似的广告ULT。这可能是可以刺略晚于幼虫和精确的计时一定要选择适合所研究的问题。然而,这取决于处理上的问题,但它通常将是必要文化的VNCs的一些时间来观察细胞的反应损伤。一段时间后,120小时AEL化蛹开始,一个时期的中枢神经系统改造,因此最好避免。因此是相当有限的时间窗口加文化中的幼虫捅死。使用幼虫仍然有很大的技术优势,使用成人同时,同样到了成年,人的神经系统已经是全功能的,分析对损伤的反应是相当容易和更快的幼虫。
当比较的大小和形态的头脑和VNCs在一盘VNCs在同等时间点,而无需在培养皿中培养后,解剖解剖和培养,发展是慢文化在体内 。在其他方面,发展进行通常在文化,组织的完整性是保留的,细胞是活的多个响应。伤口扩张,神经纤维的修复和神经胶质增生发生在22小时后捅死。这表明细胞对损伤的反应发生在文化和最有可能的时间超过一天,不需维护的外植体。如果更长的长期培养需要的话,协议可能需要进一步优化,如使用培养板插入物5。
重要的是,来识别品质好的样品从堕落的。优化这一协议需要一些技巧,不可避免地的变性会发生在一些标本。 VNC能够获得“菜花”的出现,反映了组织的完整性( 图5B)击穿。变性也空泡的VNC独立的承认刺伤,它可以是完整的,非刺的标本( 图5C </strONG>)。这些样品必须被丢弃。变性是最有可能造成粗糙的解剖,它可以撕裂的神经和神经胶质细胞表面的保护层。因此,非常小心,必须采取轻轻地解剖。其他影响因素包括培养液中,必须保持清洁,并用抗生素治疗,坚持严格的清洗和时间安排,在协议中表示。最后,针与针支架,大小和锐度的针的长度是非常重要的。针座污染的培养基,并一个钝针可能会导致大的损伤,无法自我修复,会导致退化。重要的是要经常保持针尖锐。
在这个协议中,我们利用了的蛋白质陷阱GAL4-UAS系统采用传统的胶质过程的可视化可视化的神经纤维在平行线的苍蝇。这些工具也可以结合其他的二进制表达系统,如勒xA的19和Q-系统20中 ,分别独立的GAL4。这将使为实例轴突和胶质流程之间的相互作用的分析,在对损伤的反应。它与其他遗传工具,如树突21或钙离子内流22记者通过进一步结合,这种方法提供了一个很好的机会,分析背后的损伤反应在中枢神经系统的神经胶质细胞,神经元轴突和树突的细胞生物学。最后,这种方法可以结合标准的遗传学,突变和基因的过度表达,来测试基因功能的损伤和再生的反应。
该协议已经成功地领导发现了一个基因网络的基础胶质细胞的再生中枢神经系统损伤11。由于基因功能的进化保守性,解开这些细胞的活动和功能基因在果实蝇是有可能提供重要的见解了解马mmalian中枢神经系统损伤和再生。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢林美安批判性阅读的手稿和其他成员讨论这项工作的整个过程中我们的实验室。这项工作是由由山田科学基金会和英国皇家学会的短暂访问奖学金和欧盟居里夫人国际来话团契GRR KK,和BBSRC资助计划(BB/H002278/1)和威康信托设备资助(073228/Z/03/Z,)啊
Equipment | |||
Staining block | Brunel Microscope | ||
Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
Reagent | |||
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
FBS | Sigma | F7524 | |
Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |