マイクロ流体チップの作製とインフルエンザを検出する方法
Summary
統合されたマイクロ流体チップは、熱可塑性の分子診断として使用するために開発されました。チップは、核酸抽出、逆転写酵素、およびPCRを行います。チップを製造して実行するための方法が記載されている。
Abstract
迅速かつ効果的な診断は、効果的な患者の管理と治療を可能にすることによって、感染症の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、患者の鼻咽頭（NP）スワブおよび吸引液中のインフルエンザウイルスを増幅する機能を持つ統合されたマイクロ流体チップの熱可塑性を提示する。患者サンプルのロード時に、マイクロ流体デバイスは、順次、オンチップ細胞溶解、RNA精製および固相抽出（SPE）、逆転写（RT）とRT-PCRチャンバー内のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）内の濃縮工程を実施それぞれ。終点検出は、オフチップバイオアナライザー（Agilent Technologies社、サンタクララ、CA）を使用して実行されます。 2薄膜ヒータは、RTおよびPCRチャンバー用の熱源として使用されていましたが周辺機器のために、私たちは、試薬やサンプルを駆動するために、単一のシリンジポンプを使用していました。チップはfabricatiを低減するために、高スループット製造のために、単層と適当になるように設計され時間とコストで。マイクロ流体チップは、関心のある新しい病原体を検出するために必要な試薬の設計変更によってのみ制限されるウイルスや細菌の多種多様な、分析するためのプラットフォームを提供します。
Introduction
数百万人の死者は、20世紀1の3つのインフルエンザのパンデミックの間に報告されている。また、最新のインフルエンザの大流行は2009年に世界保健機関（WHO）2によって宣言された、とのように2010年8月1日の、18449人の死亡がWHOの3によって報告されました。このパンデミックは再び感染症の高負荷、高速疾患の確認、適切な公衆衛生対応と効果的な治療4を有効にするには 、インフルエンザの迅速かつ正確な検出のための必要性を示した。
広くインフルエンザを診断するために使用されるいくつかの方法があり、これらは急速イムノアッセイ、直接蛍光抗原検査（DFA）とウイルス培養方法を挙げることができる。他の2つの方法は労働集約的で時間9消費している間に急速なイムノアッセイは劇的に、感度5-8を欠いている。分子テストは高いsensit、短いターンアラウンド時間を含む複数の利点を提供ivity、高い特異性。いくつかの商業団体は、感染症のための速い分子テスト（とも呼ばれる核酸テストやNAT）に向かって取り組んできており、いくつかは彼らのパイプラインでインフルエンザアッセイを持っています。しかしそれらのほとんどは、オフチップのサンプル調製を必要とします。分子テストはアッセイ用カートリッジまたはモジュールに試料調製を組み込む放棄臨床検査改善修正法（CLIA）のなし。
ラボオンチップ技術は、ポイント·オブ·ケア検査装置の開発に重要な役割を果たしている。 1993年10における第1のPCRチップの導入後、数々の努力が核酸テストチップの開発に置かれている。しかし、これらは数が限られて下流の増幅を伴う原油試料調製を統合した。
我々は以前プラスチックマイクロ流体チップ11に固相抽出カラム（SPE）の小型化を実証し、開発しました連続した流れのPCRチップ12のリーメントと最適化。ここでは、臨床診断のための単一のチップにRTおよびPCR手順でSPEを統合し、患者の鼻咽頭（NP）スワブおよび吸引液から核酸を増幅するために、その能力を実証するために前作を拡張します。
Protocol
Representative Results
Discussion
診断方法は、高い特異性と低い検出限界を持つ患者検体からインフルエンザRNAを増幅するための統合されたマイクロ流体プラスチックチップの能力を実証してここで紹介する13我々は、ケア検査の潜在的な点については、このチップを設計した：（a）温度と流体制御が簡素化された、（b）のチップは、低コストおよび射出成形を用いた高スループットの製造に適しており、（c）のチ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国立衛生研究所（NIH）助成金R01 EB008268によってサポートされていました。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
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