Fabrication puce microfluidique et méthode pour la détection de la grippe
Summary
Une puce microfluidique intégré thermoplastique a été mis au point pour une utilisation comme diagnostic moléculaire. La puce effectue l'extraction d'acide nucléique, la transcriptase inverse et la PCR. Des procédés de fabrication et le fonctionnement de la puce sont décrits.
Abstract
Diagnostics rapides et efficaces jouent un rôle important dans le contrôle des maladies infectieuses en permettant une gestion efficace des patients et le traitement. Ici, nous présentons une puce microfluidique intégré thermoplastique avec la capacité d'amplifier le virus grippal A dans les patients nasopharyngé (NP) des tampons et des ponctions. Lors du chargement de l'échantillon du patient, le dispositif microfluidique porte successivement sur la lyse des cellules sur puce, la purification de l'ARN et des étapes de concentration au sein de l'extraction en phase solide (SPE), la transcription inverse (RT) et la réaction en chaîne par polymérase (PCR) en RT-PCR chambres, respectivement. Point final de détection est réalisée à l'aide d'un Bioanalyzer hors puce (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Pour les périphériques, nous avons utilisé une pompe à seringue unique à conduire des réactifs et des échantillons, tandis que deux appareils de chauffage à couches minces ont été utilisés comme source de chaleur pour la RT et la PCR chambres. La puce est conçue pour être simple couche et adaptée pour la fabrication à haut débit pour réduire la fabricatile temps et le coût. La puce microfluidique offre une plateforme pour analyser une grande variété de virus et de bactéries, limitée seulement par des changements dans la conception des réactifs nécessaires à la détection de nouveaux agents pathogènes d'intérêt.
Introduction
Des millions de décès ont été rapportés au cours des trois pandémies de grippe du 20e siècle 1. En outre, la pandémie de grippe la plus récente a été déclarée par l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) 2 en 2009, et à partir de Août 1, 2010, 18 449 décès ont été signalés par l'OMS 3. Cette pandémie a démontré encore une fois la forte charge de maladies infectieuses, et la nécessité d'une détection rapide et précise de la grippe pour permettre la confirmation des maladies rapide, appropriée réponse de santé publique et un traitement efficace 4.
Il existe plusieurs méthodes couramment utilisées pour le diagnostic de la grippe, il s'agit notamment de tests immunologiques rapides et directs tests immunofluorescence (DFAE) et les méthodes de culture virale. Immunoessais rapides considérablement manquent de sensibilité 5-8, tandis que les deux autres méthodes sont de main-d'œuvre et de temps 9. Les tests moléculaires offrent de multiples avantages, y compris un demi-tour peu de temps, SENSIT hauteivité, et une plus grande spécificité. Plusieurs entités commerciales ont travaillé à des tests moléculaires rapides (également appelés tests des acides nucléiques ou des NAT) pour les maladies infectieuses, et plusieurs ont des tests de la grippe dans leurs pipelines. Cependant, la plupart d'entre eux nécessitent la préparation d'échantillons hors puce. Aucun des amendements Clinical Laboratory Improvement (CLIA) a renoncé à des tests moléculaires incorporer la préparation des échantillons d'essai dans la cartouche ou module.
Lab-on-a-chip technologie joue un rôle important dans le développement de dispositifs de contrôle de point de soins. Après l'introduction de la première puce PCR en 1993 10, de nombreux efforts ont été consacrés au développement nucléiques puces de test d'acide. Cependant, seuls quelques-uns d'entre eux ont intégré la préparation des échantillons brut avec une amplification en aval.
Nous avons précédemment démontré la miniaturisation d'une colonne d'extraction en phase solide (SPE) dans une puce microfluidique en plastique 11 et la mise au pointment et l'optimisation d'une puce PCR à flux continu 12. Ici, nous étendons les travaux antérieurs d'intégrer la SPE avec RT et la PCR en une seule puce pour les diagnostics cliniques et démontrer sa capacité à amplifier les acides nucléiques de patients nasopharyngé (NP) des tampons et des ponctions.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode de diagnostic présenté ici a démontré la capacité d'une puce microfluidique intégré en plastique pour amplifier l'ARN de la grippe A partir d'échantillons de patients avec une haute spécificité et une limite de détection plus bas depuis 13 Nous avons conçu cette puce pour le point de potentiel des tests précaution:. (A) la température et fluidique de contrôle ont été simplifiées, (b) la puce est peu coûteux et convenant à la fabrication à haut débit utilisant le m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par les Instituts nationaux de la santé (NIH) subvention R01 EB008268.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
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