마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법
Summary
통합 마이크로 열가소성 칩은 분자 진단으로 사용하기 위해 개발되었습니다. 이 칩은 핵산 추출, 역 transcriptase 및 PCR을 수행합니다. 제조 및 칩을 실행하기위한 방법은 설명되어 있습니다.
Abstract
빠르고 효과적인 진단은 효과적인 환자 관리 및 치료를함으로써 전염병을 제어하는 데 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 환자 nasopharyngeal (NP) 면봉과 aspirates의 인플루엔자 바이러스를 증폭 할 수있는 능력을 통합 마이크로 열가소성 칩을 제시한다. 환자 샘플을로드하면, 마이크로 유체 장치는 순차적으로, 온칩 세포 용해, RNA 정화 및 고체 위상 추출 (SPE), 역 전사 (RT) 및 RT-PCR 챔버에서 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 농도 단계를 수행 각각. 엔드 포인트 검출은 오프 칩 Bioanalyzer을 (애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA)를 사용하여 수행됩니다. 이 박막 히터는 RT와 PCR 챔버의 열원으로 사용하는 동안 주변 기기를 들어, 우리는 시약 및 샘플을 늘리기 위해 하나의 주사기 펌프를 사용했습니다. 이 칩은 fabricati을 줄이기 위해 높은 처리량 제조를위한 단일 레이어와 적합하도록 설계되어시간과 비용 있습니다. 마이크로 칩은 관심의 새로운 병원균을 감지하는 데 필요한 시약 디자인의 변화 만 제한 바이러스와 박테리아의 다양한 분석 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
수백만 명의 죽음은 20 세기 1 세 인플루엔자 전염병 동안보고되었습니다. 또한, 가장 최근의 인플루엔자 유행은 2009 년에 세계 보건기구 (WHO) 2로 선언되었고, 같은 2010년 8월 1일의, 18,449 사망자는 WHO 3보고되었다. 이 유행은 다시 전염성 질병의 높은 부담, 및 빠른 질병 확인, 적절한 공중 보건 대응하고 효과적인 치료 4 활성화 인플루엔자의 신속하고 정확한 탐지의 필요성을 보여 주었다.
널리 독감을 진단에 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다, 이들은 빠른 immunoassays 직접 형광 항원 검사 (DFA) 및 바이러스 성 문화 방법이 포함되어 있습니다. 다른 두 방법은 노동 집약적 인 9 소비 시간이있는 동안 급속한 immunoassays은 극적으로, 감도 5-8가 부족합니다. 분자 테스트는 짧은 턴 – 주위에 시간, 높은 sensit 등의 여러 장점을 제공합니다ivity, 높은 특이성. 여러 상업 기관은 전염병에 대한 빠른 분자 테스트 (또한 핵산 검사 또는 NATs이라고도 함)으로 작업되었으며, 몇은 파이프 라인에서 인플루엔자 assays 있습니다. 그러나 대부분은 오프 칩 샘플 준비가 필요합니다. 분자 검사 검정 카트리지 나 모듈에 샘플 준비를 통합 면제 임상 실험실 개선 개정 (CLIA)의 없음.
랩 – 온 – 어 – 칩 기술은 포인트의 케어 테스트 장치의 개발에 중요한 역할을한다. 1993 10 첫 번째 PCR 칩의 도입 후, 많은 노력 핵산 테스트 칩을 개발에 투입되었습니다. 그러나, 이들의 몇은 하류 증폭과 통합 원유 샘플 준비되어 있습니다.
우리는 이전에 플라스틱 마이크로 칩 11으로 견고한 위상 추출 컬럼 (SPE)의 소형화을 입증하고 개발 한연속 흐름 PCR 칩 12 ment 및 최적화. 여기, 우리는 임상 진단을위한 단일 칩에 RT와 PCR 단계로 SPE를 통합하고 환자 nasopharyngeal (NP) 면봉과 aspirates에서 핵산을 증폭하기위한 능력을 평가하는 이전 작업을 확장합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
진단 방법은 높은 특이성과 낮은 검출 한계가있는 환자 표본에서 인플루엔자 RNA를 증폭 할 수있는 통합 마이크로 플라스틱 칩의 능력을 보여 여기에 제시된 13 우리는 케어 테스트의 잠재적 지점이 칩을 설계 :. (A) 온도와 유체 컨트롤이 간단했다, (b)는 칩은 낮은 비용과 사출 성형을 사용하여 높은 처리량 제조에 적합, 그리고 (c) 칩은 따라서 표본 교차 오염의 우려를 줄이고, 종이 및…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 건강의 국립 연구소 (NIH) 보조금 R01 EB008268에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. . Transducer’93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -. C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
