Mikrofluid chip fabrikation og metode til at påvise Influenza
Summary
En integreret microfluidic termoplastisk chip er udviklet til brug som en molekylær diagnostisk. Chippen udfører nukleinsyre ekstraktion, revers transkriptase og PCR. Fremgangsmåder til fremstilling og drift chippen er beskrevet.
Abstract
Hurtig og effektiv diagnostik spiller en vigtig rolle i at kontrollere smitsomme sygdomme ved at aktivere en effektiv patient håndtering og behandling. Her præsenteres en integreret mikrofluid termoplastisk chip med evnen til at amplificere influenza A-virus i patientens nasopharynx (NP) podninger og aspirater. Ved indlæsning af patientprøven, sekventielt den mikrofluid enhed udfører on-chip cellelyse, RNA-oprensning og koncentrering i fastfase-ekstraktion (SPE), revers transkription (RT) og polymerasekædereaktionen (PCR) i RT-PCR kamre, hhv. Slutpunkt detektering udføres med en off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Efter enheder, anvendte vi en enkelt sprøjtepumpe at drive reagens og prøver, mens to tyndfilm varmeapparater blev anvendt som varmekilder til RT og PCR kamre. Chippen er designet til at være enkelt lag og egnet til high throughput fremstilling at reducere fabricatipå tid og omkostninger. Den mikrofluid chip er en platform til at analysere en lang række virus og bakterier, kun begrænset af ændringer i reagens design nødvendige for at detektere nye patogener af interesse.
Introduction
Millioner af dødsfald er rapporteret i løbet af de tre influenzapandemier i det 20. århundrede 1. Desuden blev den seneste influenzapandemi anmeldt af World Health Organization (WHO) 2 i 2009, og som 1. august 2010 blev 18.449 dødsfald rapporteret af WHO 3. Denne pandemi demonstreret den store byrde af smitsomme sygdomme, og behovet for hurtig og nøjagtig påvisning af influenza, så hurtigt sygdom bekræftelse, passende folkesundhedsmæssig reaktion og effektiv behandling 4.
Der findes flere metoder i vid udstrækning anvendes til diagnosticering af influenza, disse omfatter hurtige immunoassays, direkte fluorescerende antigen test (DFA) og virale dyrkningsmetoder. Rapid immunoassays dramatisk mangler følsomhed 5-8, mens de to andre metoder er arbejdskrævende og tidskrævende 9. Molekylære test tilbyder flere fordele, herunder en kort turn-around tid, høj SENSITivity, og højere specificitet. Adskillige kommercielle foretagender har arbejdet hen imod hurtige molekylære test (også kaldet nukleinsyre-test eller NAT) for smitsomme sygdomme, og flere har influenza assays i deres rørledninger. Men de fleste af dem kræver off-chip prøveforberedelse. Ingen af det kliniske laboratorium Improvement Ændringer (cLIA) afkald molekylære test inkorporere prøveforberedelse i analysen patron eller modul.
Lab-on-a-chip teknologi spiller en vigtig rolle i udviklingen af point-of-care testanordninger. Efter indførelsen af den første PCR-chip i 1993 10, er mange bestræbelser blevet bragt i udviklingen af nucleinsyre-test chips. Det er dog kun et fåtal af disse har integreret råt prøveforberedelse med downstream forstærkning.
Vi har tidligere demonstreret miniaturisering af et fastfaseekstraktionskolonne (SPE) i en plast mikrofluid chip 11 og den udviklerling og optimering af en kontinuerlig strøm PCR chip 12. Her vil vi udvide det hidtidige arbejde for at integrere SPE med RT og PCR trin i en enkelt chip til klinisk diagnostik og vise sin evne til at forstærke nukleinsyrer fra patientens nasopharynx (NP) podninger og aspirater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den diagnostiske metode præsenteret her viste evnen hos en integreret mikrofluid plastic chip at amplificere influenza A RNA fra patientprøver med høj specificitet og en lav påvisningsgrænse 13 Vi har designet denne chip for potentielle point of care test:. (A) temperaturen og strømningstekniske kontrol blev forenklet, (b) chippen er billigt og egnet til high throughput fremstilling ved hjælp af sprøjtestøbning, og (c) chippen er til engangsbrug og beregnet til engangsbrug, hvorved bekymring prøve k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R01 EB008268.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. . Transducer’93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -. C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
