Summary
单核细胞源性巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞。这里，我们描述一个易于使用的
Abstract
单核细胞源性巨噬细胞的一个重要的先天免疫系统的细胞不同的。遭受巨噬细胞生物学研究的小鼠模型小鼠和人类之间的单核细胞源性巨噬细胞的表型和功能的差异。因此，我们在这里描述的生成和学习初级人类巨噬细胞的体外模型。简言之，密度梯度离心，从前臂静脉抽血周后，单核细胞分离出外周血单核细胞，使用负磁珠隔离。在这些单核细胞，然后在特定的条件下培养6天后，诱导巨噬细胞的分化或极化的不同类型的。该模型是易于使用和规避鼠标和男人之间的种属特异性的差异所造成的问题。此外，它更接近体内条件比永生化细胞系的使用。最后，这里所描述的模型适合研究巨噬细胞ê生物学，找出疾病的机制和新的治疗靶点。即使不能完全代替实验动物或人体组织获得验尸 ，这里所描述的模型允许疾病可能是高度相关的各种人类疾病的机制和治疗靶点的识别和验证。
Introduction
单核细胞源性巨噬细胞的一个重要的先天免疫系统的细胞成分和向许多急性或慢性的炎症过程1。巨噬细胞发挥 了重要作用，在许多炎症性疾病，如动脉粥样硬化或癌症2。巨噬细胞表现出高度的可塑性，能够承担不同的表型，这取决于在当地micromilieu 3。因此，巨噬细胞分化和异质性研究是必不可少的许多疾病的病理生理增加我们的知识，并让新的治疗靶点的识别和开发新的疗法。
在许多情况下，小鼠模型用于研究特定疾病的病理生理学。然而，使用小鼠模型研究巨噬细胞生物学是伴随着一些缺点：（1）白细胞子集数的比例（ 即单核细胞和粒细胞）在侏罗纪大庆外围的老鼠或人类的血液显著不同建议单核细胞在小鼠和人类生理的不同角色。 （2）建议实质性的差异，它们的功能在健康和疾病4的小鼠和人类外周血单核细胞之间的基因表达有很大差异。 （3）数的标记，用来识别小鼠单核细胞和巨噬细胞（F4/80，LYC 等 ），人类髓系细胞中不存在，使转移的小鼠模型中的结果的人的情况，而难以。
因此，为了提高我们的理解在人类疾病中的巨噬细胞分化和异质性，我们需要利用模型与人类巨噬细胞。因此，我们在这里描述的模型人原发性巨噬细胞产生的，并且容易使用，并允许在各种条件下产生的在不同的巨噬细胞婆的人单核细胞源性巨噬细胞的体外研究偏振类型。在几项研究中，我们已经使用了单核细胞衍生的原代人巨噬细胞的体外模型分析巨噬细胞生物学和其潜在的相关人类动脉粥样硬化5-7。
即使不能完全代替实验动物或人体组织获得验尸 ，这里所描述的模型允许疾病可能是高度相关的各种人类疾病的机制和治疗靶点的识别和验证。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。协议
- 准备缓冲器，如下所示：
- 准备缓冲对PBMC隔离：“洗净缓冲区”= 0.02％EDTA在PBS（使用0.5 M EDTA）。
- 准备的缓冲液单核细胞的分离：“MACS漂洗缓冲液”= 0.5％BSA（250毫克）+ 2mM的EDTA（200微升）+ PBS（50ml）中。脱气缓冲液中。
- 准备缓冲FACS染色和存储单元：“流式细胞仪缓冲”= 10％FCS的PBS和“固定缓冲区”= 1％PFA固定。
- 从前臂静脉绘制30毫升全血。使用EDTA抗凝。
- 隔离如下（PBMC HISTOPAQUE）：
- 准备两个无菌的50毫升管（聚苯乙烯）。
- 从第2步用PBS 1:1稀释血液。
- 加入25毫升HISTOPAQUE的每管25毫升全血/ PBS。 ，确保HISTOPAQUE和血液不混合。
- 以400×g离心30分钟，在室温下，不加制动。
- 吸血浆和丢弃。
- 吸不透明接口和吸管成清洁50毫升浴缸Ê。
- 加入20毫升0.02％EDTA在PBS中。
- 在4℃下离心5分钟，在250×g离心
- 弃上清。
- 加入10毫升0.02％EDTA在PBS中。
- 计数细胞，如下所示：
- 涡旋10秒拌匀。
- 取200微升细胞悬液+ 300微升0.02％EDTA在PBS + 500微升台盼蓝（200-500 cells/10广场，否则改变稀释倍数）。
- 执行如下的单核细胞的负隔离：
- 在步骤3.10中获得的细胞10分钟，120×g下离心。弃上清。
- 通过加入10毫升的PBS + 0.02％EDTA和10分钟，120×g下离心洗涤细胞沉淀2倍。
- 加入9毫升无菌水，持续3秒，加入1 ml 10X PBS。
- 用PBS + 0.02％EDTA洗一次，离心10分钟，120 X G。
- 伯爵在离心过程中。
- ，在EasySep缓冲液稀释，以5×10 7个/ ml。
- 添加50μL/毫升的单核细胞富集公鸡尾巴。
- 孵育10分钟，在4℃下
- 旋涡有孔玻璃珠，持续30秒。
- 加入50微升/毫升的有孔玻璃珠。
- 孵育5分钟，在4℃下
- EasySep缓冲区填写完成量为2.5毫升。现在的解决方案出现褐色。
- 放入磁铁。
- 在室温下等待2.5分钟。在这段时间内将移动到管壁非单核细胞磁珠结合，并坚持在那里。
- 新鲜的无菌试管中倒入缓冲液不具约束力的单核细胞。这个解决方案看起来发白。
- 用PBS + 0.02％EDTA洗一次，10分钟，120×g下离心。
- 板在塑料盘或多层盘的密度为0.5×10 6个/ cm 2的细胞。加入1 ml的培养基/ 1×10 6个细胞。
- 利益的条件下培养细胞为6-14天。
- 更换介质后3天更换50％的媒体与新媒体（ 见表1）。
- 经过6天收获细胞mRNA分离，流式细胞仪，免疫印迹法等 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
通过上述协议，我们经常得到25.1×10 6±2.2×10 6 monocytes/100关于毫升血（平均值±标准差从26个独立的实验， 图1A）。经常由流式细胞仪染色CD14是单核细胞纯度大于95％（97.1±0.4％，平均值±标准误差由3个独立的实验中， 图1B）。新鲜分离的单核细胞，用台盼蓝染色测定细胞存活率大于95％（数据未示出）是常规。虽然最初细胞呈圆形和浮动，他们通常会开始坚持的几个小时内。依从性相关与向“煎鸡蛋”或纺锤状的形状（ 图2）的形状变化。与M-CSF（100毫微克/毫升），有或没有另外的氧化LDL（100微克/毫升，在过去的24小时）培养六天后，大约80％的不暴露于氧化低密度脂蛋白的细胞是可行的，而特雷与oxLDL的atment导致约70％的活细胞（ 图3）中。后6天的文化和M-CSF的流式细胞仪演示，而细胞表达白细胞标记CD45RO，他们下调单核细胞标记CD14（ 图4）。特定条件下可能会诱发巨噬细胞的极化- ，从而M1或M2偏振光的巨噬细胞的表达典型的标记物，如IL-6，肿瘤坏死因子-α（M1）或CD36和CD206（M2）（ 图5）。巨噬细胞可以进一步功能实验研究。例如，氧化LDL的摄取，可以研究使用荧光标签LDL（ 图6）。
图1。 （A）负珠隔离后获得的外周血单核细胞数。手机号码正常化d为末梢血100毫升。 26个独立的实验数据（B）获得纯度的单核细胞，使用流式细胞仪测定负珠隔离。代表向前侧散点图和直方图CD14染色阴性对照，如虚线所示。
图2。 M-CSF细胞后第3和第6天的文化。比例尺= 50微米。
图3。经过6天的文化与M-CSF或与M-CSF和氧化低密度脂蛋白（100微克/毫升）经过6天的文化巨噬细胞的可行性在过去的24小时增加侧SC代表着由碘化丙啶（PI）染色。的东北黑钙土图和柱状图为PI染色。
图4。新鲜分离的单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞培养6天，用M-CSF（100毫微克/毫升）后，单核细胞标记物CD14的流式细胞仪。
图5。基因表达的IL-6，TNF-α，CD36和CD206（甘露糖受体）与M-CSF（100毫微克/毫升，6天）和偏振朝向M1表型（LPS，100 ng / ml的人巨噬细胞分化初级，和IFN-γ，20毫微克/毫升，在过去的18小时）或M2（IL-4，20毫微克/毫升的最后18小时）。基因表达定量PCR测定。 * P <0.05，** P <0.01;
图6。 （A）的M-CSF-诱导的巨噬细胞的人巨噬细胞的免疫荧光图像。细胞暴露于10μg/ ml的DiI荧光标记的氧化型低密度脂蛋白4小时。细胞核用DAPI染色。比例尺=50μm的（B）代表直方图的M-CSF-诱导的人巨噬细胞摄取oxLDL的DiI荧光流式细胞仪测量。灰色=未治疗的对照，黑色线=氧化低密度脂蛋白处理的巨噬细胞。
| 类型 | 条件 | 参考文献 |
| M0 |
| 7-8 | M1 |
| 8 |
| 9-10 | |
| 9 | |
| 10 | |
| 10 | |
| M2A |
| 9-10 |
| 8 | |
| 10 | |
| 8 | |
| M2b型 |
| 8 |
| M2C |
| 10 |
| M4 |
| 7 |
| M-血红蛋白 |
| 11 |
| M-OX | 12 | |
| 其他类型的巨噬细胞 |
| 13 |
表1中。例如建立M1或M2巨噬细胞极化类型的条件和典型标志（请参见特定的隔离程序或细胞培养条件的参考）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
单核细胞源性巨噬细胞的先天免疫系统的主要细胞类型的代表。他们发挥了重要的作用，在许多炎症性疾病，包括动脉粥样硬化或癌症2。因此，巨噬细胞的生物学研究是必不可少的许多疾病的病理生理学增加我们的知识，并允许开发新的疗法。
许多研究应用小鼠模型的过度表达或缺乏某些基因的利益。在单核细胞源性巨噬细胞的情况下，这似乎不是最好的方法来研究人类疾病有关的过程有很大差异小鼠和人类之间的单核细胞和单核细胞源性细胞4。因此，利用主人体细胞似乎有效的模型研究疾病相关巨噬细胞的分化机制的一个很好的替代。
这里介绍的是一个明显的优势， 在体外模型，它不依赖于immortali的ZED等细胞株THP-1或其他14-15。虽然细胞系中可以很容易地得到规避需要定期抽血，细胞系的表型和功能上不相同的原代细胞。因此，Cho 等人都比较初级人类巨噬细胞的基因签名和他们相比此前公布的数据，获得从THP-1 12,14。他们发现了一个显着，但温和表明THP-1细胞未必是理想模型来研究巨噬细胞分化和异质性，在许多情况下，这两种细胞类型之间的相关性。此外，有各种型号如何区分非贴壁的单核细胞样对巨噬细胞的THP-1细胞。即使使用可能是最适用的协议，其中THP-1细胞用PMA处理后五天没有PMA（PMAr）搁在文化，细胞不完全像原代细胞16。总而言之，这些研究结果表明，人类疾病的研究在细胞水平上的机制，原发性巨噬细胞似乎更适合细胞系。
一个人必须知道的其他方法，让初级人类单核细胞的隔离：坚持以塑料，正 珠隔离，或逆流离心淘洗17。这里使用的单核细胞富集鸡尾酒含有抗体对CD2，CD3，CD16，CD19，CD20，CD56，CD66b，CD123，糖蛋白A和右旋糖酐涂层的磁性粒子。这些抗体结合的抗原决定簇上随后可以绑定磁性粒子的单核细胞以外的白细胞，管被保持在由磁场而所有未结合的单核细胞可以被转移到第二个管。此外，浓缩鸡尾酒包含人Fc受体（高表达单核细胞），单核细胞，以防止非特异性结合的抗体。因此，这里介绍的方法产生具有高的纯度的“原封不动”非活化的单核细胞。
有几点需要牢记，当应用此模型。聚蔗糖/ HISTOPAQUE应在室温下进行离心分离。 EDTA缓冲液洗我必要对抑制整合素依赖性结合的血小板，单核细胞。重要的是种子的单核细胞在合适的密度，以实现最佳的分化。这两种播种单核细胞太松或太密集的结果不理想的生长和分化。更改的选项包括在特定的基材上播种细胞，或使用不同的生长因子（ 如 GM-CSF 18）或另外的特定的细胞活化剂（ 如细胞因子或LPS 8， 表1）。
使用来自不同个体的细胞可能会导致更大程度的变化有关特定的蜂窝电话功能的。因此，马丁-Fuentes的等人已经证明，从不同的个体的单核细胞源性巨噬细胞显示不同的能力，LDL摄取19。有趣的是，这些差异来自不同捐赠者的细胞间的变化是没有随着时间的推移保持稳定由于不同的实验条件，而是反映了个体遗传或表观遗传差异。这个较大的变化，一方面，需要更大的数字，取得显著成果，在具体的实验，如氧化低密度脂蛋白的摄取。相比之下，这些差异也使研究人员能够在细胞水平上，从而揭示新的疾病机制研究健康和患病个体之间的差异。
总体而言，这里描述的协议是使用简便，重现性好，获得非常纯净的单核细胞，然后可以对巨噬细胞分化的人群。根据不同的培养条件下，单核细胞源性巨噬细胞的各种类型的可允许鉴定特定的生理或病理生理过程，人类疾病有关的研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有透露任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢纳丁Wambsganss，优良的技术援助。通过CAG创新基金FRONTIER（海德堡大学）的资助，这项工作是由授出德意志研究联合会（GL599/1-1）和部分支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
- Gordon, S., Taylor, P. R.
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M.
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
- Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
- Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
- Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
- Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
- Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
- Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
- Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
- Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).
