Un<em> In vitro</em> Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione
Summary
Derivate da monociti macrofagi sono cellule importanti del sistema immune innato. Qui, descriviamo un facile da usare<em> In vitro</em> Modello per generare queste cellule. Utilizzando centrifugazione in gradiente, isolamento perlina negativo e specifiche condizioni di coltura cellulare, macrofagi derivate da monociti possono essere generati per studi fenotipici e funzionali.
Abstract
Macrofagi derivate da monociti rappresentano un importante tipo di cellule del sistema immune innato. Modelli murini che studiano la biologia dei macrofagi soffrono delle differenze fenotipiche e funzionali tra murine e umane derivate da monociti macrofagi. Pertanto, noi descriviamo qui un modello in vitro per generare e studiare macrofagi umani primari. In breve, dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue periferico prelevato da una vena dell'avambraccio, monociti sono isolati da cellule mononucleate del sangue periferico utilizzando negativo magnetico isolamento tallone. Questi monociti vengono poi coltivate per sei giorni in condizioni specifiche per indurre diversi tipi di differenziamento macrofagi o polarizzazione. Il modello è facile da usare e elude i problemi causati dalle differenze specie-specifiche tra topo e uomo. Inoltre, è più vicino alla condizioni in vivo che l'uso di linee cellulari immortalizzate. In conclusione, il modello qui descritto è adatto per studiare macrophage biologia, individuare meccanismi di malattia e nuovi target terapeutici. Anche se non sostituendo completamente gli esperimenti con gli animali o tessuti umani ottenuti post mortem, il modello qui descritto consente l'identificazione e la validazione dei meccanismi della malattia e bersagli terapeutici che possono essere molto importanti per diverse patologie umane.
Introduction
Macrofagi derivate da monociti rappresentano un importante componente cellulare del sistema immunitario innato e contribuiscono a molti processi infiammatori acuti o cronici 1. I macrofagi giocano un ruolo importante in molte malattie infiammatorie come l'aterosclerosi o il cancro 2. Macrofagi mostrano un elevato grado di plasticità e sono in grado di assumere differenti fenotipi seconda del micromilieu locale 3. Così, studiando la differenziazione dei macrofagi e l'eterogeneità è essenziale per aumentare la nostra conoscenza della fisiopatologia di molte malattie e per consentire l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e lo sviluppo di nuove terapie.
In molti casi, i modelli murini sono usati per studiare la fisiopatologia di malattie specifiche. Tuttavia, lo studio della biologia dei macrofagi utilizzando modelli murini è accompagnato da numerose carenze: (1) La percentuale dei numeri sottoinsieme di leucociti (ossia monociti e granulociti) in peripHeral sangue di topi o esseri umani differisce significativamente suggerendo diversi ruoli dei monociti in fisiopatologia murine e umane. (2) Non ci sono sostanziali differenze nell'espressione genica tra murine e umane monociti del sangue periferico che suggeriscono differenze sostanziali nella loro funzione durante la salute e la malattia 4. (3) Un numero di marcatori che vengono utilizzati per identificare i monociti e macrofagi murini (F4/80, LYC, ecc.) Non esiste in cellule mieloidi umane, rendendo il trasferimento dei risultati in modelli murini per la situazione umana piuttosto difficile.
Pertanto, al fine di aumentare la nostra comprensione della differenziazione dei macrofagi e l'eterogeneità nella malattia umana, abbiamo bisogno di fare uso di modelli di lavoro con i macrofagi umani. Pertanto, noi qui descriviamo un modello di generazione macrofagi primari umani che è facile da usare e permette studio dei macrofagi derivate da monociti umani in vitro in condizioni diverse conseguente diversa macrofagi PoTipi di vascolarizzazione. In diversi studi, abbiamo usato il modello in vitro di monociti derivati da macrofagi umani primari per analizzare la biologia dei macrofagi e la sua potenziale rilevanza per l'aterosclerosi umana 5-7.
Anche se non sostituendo completamente gli esperimenti con gli animali o tessuti umani ottenuti post mortem, il modello qui descritto consente l'identificazione e la validazione dei meccanismi della malattia e bersagli terapeutici che possono essere molto importanti per diverse patologie umane.
Protocol
Representative Results
Discussion
Macrofagi derivate da monociti rappresentano il tipo cellula fondamentale del sistema immune innato. Essi svolgono un ruolo importante in molte malattie infiammatorie comprese aterosclerosi o cancro 2. Pertanto, lo studio della biologia dei macrofagi è essenziale per aumentare la nostra conoscenza sulla fisiopatologia di molte malattie e per consentire lo sviluppo di nuove terapie.
Molti studi si applicano modelli di topo iperespressione o privi alcuni geni di interesse. Nel caso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Nadine Wambsganss per l'eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) e in parte da una sovvenzione da parte del Fondo Innovazione FRONTIER (Università di Heidelberg) a CAG
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
- Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
- Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
- Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
- Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
- Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
- Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
- Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
- Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).
