Summary
Monocytafledte makrofager er vigtige celler i det medfødte immunsystem. Her beskriver vi en nem at bruge
Abstract
Monocytafledte makrofager udgør en vigtig celletype af det medfødte immunsystem. Musemodeller studerer makrofag biologi lider fænotypiske og funktionelle forskelle mellem murine og humane monocyt-afledte makrofager. Derfor har vi her beskrive en in vitro-model til at generere og studere primære humane makrofager. Kort fortalt, efter densitetsgradientcentrifugering af perifert blod udtaget fra en underarm vene, er monocytter isoleret fra perifere mononukleære celler ved anvendelse af negativ magnetisk perle isolation. Disse monocytter dyrkes derefter i seks dage under særlige betingelser at inducere forskellige typer af makrofag differentiering eller polarisering. Modellen er let at bruge og omgår problemerne med artsspecifikke forskelle mellem mus og menneske. Desuden er det tættere på in vivo end anvendelsen af immortaliserede cellelinier. Konklusionen er, at modellen er beskrevet her er egnet til at studere macrophage biologi, identificere sygdomsmekanismer og nye terapeutiske mål. Selvom ikke fuldt ud erstatte forsøg med dyr eller humane væv opnået post mortem, modellen er beskrevet her tillader identifikation og validering af sygdomsmekanismer og terapeutiske mål, der kan være yderst relevant for forskellige menneskelige sygdomme.
Introduction
Monocytafledte makrofager udgør en vigtig cellulær komponent af det medfødte immunsystem og bidrager til mange akutte eller kroniske inflammatoriske processer 1.. Makrofager spiller en vigtig rolle i mange inflammatoriske sygdomme som åreforkalkning eller kræft 2. Makrofager udviser en høj grad af plasticitet og er i stand til at antage forskellige fænotyper afhængigt af den lokale micromilieu 3.. Således studere makrofag differentiering og heterogenitet er vigtig for at øge vores viden om patofysiologien af mange sygdomme og for at tillade identifikation af nye terapeutiske mål og udvikling af nye behandlingsformer.
I mange tilfælde er murine modeller anvendt til at undersøge patofysiologien af specifikke sygdomme. Men studerer makrofag biologi hjælp musemodeller ledsaget af flere mangler: (1) Den andel af leukocyt delmængdebetingelser numre (dvs. monocytter og granulocytter) i peripHeral blod af mus eller mennesker adskiller sig væsentligt tyder forskellige roller monocytter i murine og humane patofysiologi. (2) Der er betydelige forskelle i genekspression mellem murine og humane perifere blod monocytter tyder væsentlige forskelle i deres funktion under sundhed og sygdom 4.. (3) En række markører, der bruges til at identificere murine monocytter og makrofager (F4/80, Lyc osv.) Findes ikke i humane myeloide celler, hvilket gør overførslen af resultater i musemodeller for den menneskelige situation, temmelig vanskelig.
Således, for at øge vores forståelse af makrofag differentiering og forskelligartethed i human sygdom, er vi nødt til at gøre brug af modeller arbejder med humane makrofager. Derfor, vi her beskrive en model af humant primær makrofag generation, er nem at bruge og tillader undersøgelse af humane monocyt-afledte makrofager in vitro under forskellige betingelser resulterer i forskellige makrofag popolarisation typer. I flere studier har vi brugt in vitro model for monocytafledte primære humane makrofager til at analysere makrofag biologi og dens potentielle relevans for human åreforkalkning 5-7.
Selvom ikke fuldt ud erstatte forsøg med dyr eller humane væv opnået post mortem, modellen er beskrevet her tillader identifikation og validering af sygdomsmekanismer og terapeutiske mål, der kan være yderst relevant for forskellige menneskelige sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Protokol
- Forbered Buffere som følger:
- Forbered buffer for PBMC isolation: "Vask buffer" = 0,02% EDTA i PBS (brug 0,5 M EDTA).
- Forbered buffer for monocyt isolation: "MACS skyllepuffer" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 ul) + PBS (50 ml). Afgasse bufferen.
- Forbered buffer for FACS-farvning og opbevaring af celler: "FACS buffer" = 10% FCS i PBS og "fiksering buffer" = 1% PFA i PBS.
- Trække 30 ml fuldblod fra en underarm vene. Brug EDTA som antikoagulant.
- Isolér PBMC (HISTOPAQUE) som følger:
- Forbered to sterile 50 ml rør (ingen poly-styren).
- Fortyndet blod fra trin 2 med PBS 01:01.
- Der tilsættes 25 ml HISTOPAQUE + 25 ml fuldblod / PBS pr rør. Sørg for, at HISTOPAQUE og blod ikke blandes.
- Centrifuger ved 400 xg i 30 minutter ved stuetemperatur, uden bremse.
- Aspirer plasma og kassér.
- Aspirere uigennemsigtig interface og pipette til rent 50 ml tube.
- Der tilsættes 20 ml 0,02% EDTA i PBS.
- Centrifuger ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Supernatanten kasseres.
- Der tilsættes 10 ml 0,02% EDTA i PBS.
- Tælle celler som følger:
- Bland godt ved vortex i 10 sek.
- Tag 200 pi cellesuspension + 300 pi 0,02% EDTA i PBS + 500 pi af trypanblåt (200-500 celler/10 firkanter, ellers ændrer fortyndingsfaktor).
- Udfør negative isolation af monocytter som følger:
- Centrifuger celler opnået i trin 3.10 i 10 minutter, 120 x g. Supernatanten kasseres.
- Vask cellepellet 2x ved tilsætning af 10 ml PBS + 0,02% EDTA og centrifugeres i 10 min, 120 x g.
- Tilføj 9 ml sterilt vand til 3 sek, tilsættes 1 ml 10X PBS.
- Vask en gang mere med PBS + 0,02% EDTA og centrifugeres 10 min, 120 x g.
- Tæl under centrifugering.
- Fortynd i EasySep puffer ved 5 x 10 7 / ml.
- Tilføj 50 pi / ml monocyt berigelse pikhale.
- Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C.
- Vortex perler til 30 sek.
- Tilføj 50 gl / ml perler.
- Inkuber i 5 minutter ved 4 ° C.
- Fyld op med EasySep buffer for at fuldføre volumen på 2,5 ml. Den løsning, der nu vises brunlig.
- Putte magnet.
- Vente 2,5 minutter ved stuetemperatur. I løbet af denne tid, ikke-monocytiske celler bundet til den magnetiske perle vil flytte til rørvæggen og holde der.
- Hæld buffer med ikke-bindende monocytter til friskt, sterilt rør. Denne løsning ser hvidlig.
- Vask en gang med PBS + 0,02% EDTA og centrifugeres i 10 min, 120 x g.
- Plate celler i en plastik skål eller flerlags plade med en tæthed på 0,5 x 10 6 / cm2. Tilsæt 1 ml kulturmedier / 1 x 10 6 celler.
- Kultur celler under betingelser af interesse for 6-14 dage.
- Skift medier efter 3 dage ved at erstatte 50% af medierne med friske medier (se tabel 1 for detaljer).
- Efter seks dages høst celler til mRNA isolation, flowcytometri, Western blotting, osv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor, vi rutinemæssigt opnå 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml blod (gennemsnit ± standardafvigelse fra 26 uafhængige forsøg, figur 1A). Monocyt renhed som bestemt ved flowcytometrisk farvning for CD14 er rutinemæssigt større end 95% (97,1 ± 0,4%, gennemsnit ± standardafvigelse fra 3 uafhængige eksperimenter, figur 1B). Cellelevedygtighed af frisk isolerede monocytter som bestemt ved trypanblåt-farvning er rutinemæssigt større end 95% (data ikke vist). Mens det i begyndelsen celler er rund og flyde, de starter som regel overholde inden for et par timer. Vedhæftning er forbundet med en formændring mod en "spejlæg" eller spindel-lignende form (figur 2). Efter seks dage i kultur med M-CSF (100 ng / ml) med eller uden tilsætning af oxideret LDL (100 ug / ml for de sidste 24 timer), er omkring 80% af cellerne ikke udsættes for oxLDL levedygtig, hvorimod threeatment med oxLDL resulterede i omkring 70% levedygtige celler (figur 3). Flowcytometri efter seks dages dyrkning med M-CSF viser, at mens cellerne holder udtrykker leukocyt markør CD45RO, de nedregulere monocyt markør CD14 (figur 4). Særlige betingelser kan inducere makrofag polarisering - således M1-eller M2-polariseret makrofager udtrykker typiske markører som IL-6, TNF-alfa (M1) eller CD36 og CD206 (M2) (figur 5). Makrofager kan yderligere studeres i funktionelle eksperimenter. For eksempel kan optagelse af oxideret LDL som skal undersøges med fluorescerende etiketter LDL (figur 6).
Figur 1. (A) Antal perifere monocytter opnået efter negativ perle isolation. Celle tal er normalisered til 100 ml perifert blod. Oplysninger om 26 uafhængige forsøg. (B) Renhed af monocytter opnået ved anvendelse af negativ perle isolation som bestemt ved flowcytometri. Repræsentant frem sidespredning plot og histogram af CD14 farvning negativ kontrol vist som stiplede linje.
Figur 2. Celler efter 3 og 6 dage kultur med M-CSF. Skala bar = 50 um.
Figur 3. Levedygtighed af makrofager efter 6 dage i kultur med M-CSF eller efter 6 dage i kultur med M-CSF og oxLDL (100 ug / ml) tilsat til den sidste 24 timer som bestemt ved propidiumiodid (PI)-farvning. Repræsentant forreste side scAtter plots og histogrammer for PI farvning.
Figur 4.. Flowcytometri for monocyt markør CD14 på frisk isolerede monocytter eller monocyt-afledte makrofager efter seks dage i kultur med M-CSF (100 ng / ml).
Figur 5. Genekspression af IL-6, TNF-alfa, CD36 og CD206 (mannosereceptoren) i primære humane makrofager differentieret med M-CSF (100 ng / ml, 6 dage) og den polariserede mod en M1 fænotype (LPS, 100 ng / ml , og IFN-gamma, 20 ng / ml for de sidste 18 timer) eller M2 (IL-4, 20 ng / ml for de sidste 18 timer). genekspressionmålt ved kvantitativ PCR. * P <0,05, ** P <0,01.
Figur 6.. (A) Immunofluorescens billede af M-CSF-inducerede makrofager humane makrofager. Cellerne blev eksponeret for 10 ug / ml Dil-mærkede oxLDL i 4 timer. Kerner blev farvet med DAPI. Målestok = 50 um. (B) repræsentant histogram af flowcytometrisk måling af Dil-oxLDL optagelse af M-CSF-inducerede humane makrofager. Grå = ubehandlet kontrol, sort linje = oxLDL-behandlede makrofager.
| Type | Betingelser | Refs |
| M0 |
| 7-8 | M1 |
| 8 |
| 9-10 | |
| 9 | |
| 10 | |
| 10 | |
| M2a |
| 9-10 |
| 8 | |
| 10 | |
| 8 | |
| M2b |
| 8 |
| M2C |
| 10 |
| M4 |
| 7 |
| M-Hb |
| 11 |
| M-ox | 12 | |
| Andre makrofag typer |
| 13 |
Tabel 1. Eksempel for forhold og typiske markører for etablerede M1 eller M2 makrofag polarisering typer (se referencer til specifikke isolation procedurer eller cellekultur betingelser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monocytafledte makrofager repræsenterer den centrale celletype af det medfødte immunsystem. De spiller en vigtig rolle i mange inflammatoriske sygdomme, herunder åreforkalkning eller kræft 2.. Således studere makrofag biologi er vigtig for at øge vores viden om patofysiologien af mange sygdomme og muliggøre udviklingen af nye behandlingsformer.
Mange undersøgelser gælder for musemodeller overudtrykker eller mangler visse gener af interesse. I tilfælde af monocytafledte makrofager, synes dette ikke den bedste måde at studere processer vedrørende sygdom hos mennesker, da der er betydelige forskelle mellem murine og humane monocytter og monocytafledte celler 4.. Således gyldige modeller, der gør brug af primære humane celler synes et godt alternativ til at studere sygdomme, der er relevante mekanismer makrofag differentiering.
En klar fordel ved in vitro-model præsenteres her er, at det ikke stole på immortalized cellelinier som THP-1 eller andre 14-15. Mens cellelinjer kan let opnås, og omgå behovet for regelmæssig blodprøvetagning, cellelinier er fænotypisk og funktionelt ikke identisk med primære celler. Således Cho et al. Har sammenlignet gen underskrifter fra primære humane makrofager og sammenlignet dem med tidligere offentliggjorte oplysninger fra THP-1 12,14. De fandt en signifikant, men moderat korrelation mellem begge celletyper tyder på, at THP-1-celler ikke kan være den ideelle model til at studere makrofag differentiering og heterogenitet i mange tilfælde. Der er også forskellige modeller hvordan man kan skelne ikke-klæbende monocyt-lignende THP-1 celler mod makrofager. Selv når du bruger nok mest gældende protokol, hvor THP-1 celler behandles med PMA efterfulgt med fem dage hviler i kultur uden PMA (PMAr), behøver cellerne ikke helt opfører sig som primære celler 16. Tilsammen tyder disse resultater på, at der for studiet af menneskets sygdommemekanismer på et cellulært niveau, primære makrofager synes mere egnet end cellelinier.
Man skal være opmærksom på andre metoder, der tillader isolering af primære humane monocytter: tilslutning til plast, positiv perle isolation eller modstrøms centrifugering elutriation 17.. Monocyt berigelse cocktail anvendt her indeholder antistoffer mod CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycophorin A og dextran-coatede magnetiske partikler. Disse antistoffer binder til epitoper på leukocytter andre end monocytter, der efterfølgende kan binde de magnetiske partikler og holdes i røret af magnetfeltet mens alle ubundne monocyt kan overføres til et andet rør. Endvidere berigelse cocktail indeholder antistoffer til human Fc-receptorer (som er højt udtrykt af monocytter), som forhindrer ikke-specifikke binding til monocytter. Følgelig metode præsenteres her giver "uberørt" ikke-aktiverede monocytter med en høj grad af renhed.
Der er nogle punkter, der skal holdes for øje, når de anvender denne model. Ficoll / Histopaque centrifugering skal udføres ved stuetemperatur. EDTA i vaskebufferen is nødvendig for at inhibere integrin-afhængig binding af blodplader til monocytter. Det er vigtigt at frø monocytter på det rigtige tæthed med henblik på at opnå optimal differentiering. Begge seeding monocytter for løst eller for tæt resultater i suboptimal vækst og differentiering. Muligheder for ændringer omfatter podning af cellerne på specifikke substrater og bruger de forskellige vækstfaktorer (f.eks GM-CSF 18) eller tilsætning af specifikke celle-aktivatorer (f.eks cytokiner eller LPS 8, tabel 1).
Anvendelse af celler opnået fra forskellige individer kan resultere i en større grad af variation med hensyn til specifikke cellulære funktioner. Således Martín-Fuentes et al. Har vist, at monocytafledte makrofager fra forskellige individer vise forskellige kapaciteter af LDL optagelse 19.. Interessant, disse forskelle forbliver stabile over tid, tyder på, at variation mellem celler fra forskellige donorer ikkepå grund af forskellige eksperimentelle betingelser, men snarere afspejler individuelle genetiske eller epigenetiske forskelle. På den ene side kræver dette større variation større tal for at opnå betydelige resultater i bestemte eksperimenter som oxLDL optagelse. Derimod også disse forskelle muligt for forskerne at studere forskelle mellem raske og syge individer på et cellulært niveau og dermed afsløre nye sygdomsmekanismer.
Samlet set protokollen beskrevet her er let at bruge, reproducerbar og nyttigt at få ekstremt rene monocyt befolkningsgrupper, som derefter kan differentieres mod makrofager. Afhængigt af dyrkningsbetingelser kan forskellige typer af monocytafledte makrofager undersøges til identifikation af specifikke fysiologiske eller patofysiologiske processer i human sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne behøver ikke at afsløre eventuelle interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Nadine Wambsganss for fremragende teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) og dels af en bevilling fra Fornyelsesfonden FRONTIER (University of Heidelberg) til CAG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
- Gordon, S., Taylor, P. R.
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M.
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
- Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
- Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
- Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
- Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
- Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
- Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
- Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
- Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).
