تقييم الظواهر الاعصاب في<em> ذبابة الفاكهة</em> الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق تسلق فحوصات والجامعة المناعية الدماغ

Summary

نحن هنا وصف اثنين من المقايسات التي تم وضعها لدراسة تنكس عصبي التي تعتمد على سن الدوبامين (DA) الخلايا العصبية في<em> ذبابة الفاكهة</em>: تسلق / باغت السلبية الناجمة عن انجذاب بالجاذبية الفحص الذي يسمح لدراسة الآثار الفنية من DA الخلايا العصبية انحطاط والمناعية هيدروكسيلاز التيروزين الذي يستخدم لتحديد وإحصاء الخلايا العصبية DA كليا يتصاعد الدماغ.

Abstract

ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو كائن نموذجا قيما لدراسة الشيخوخة والعمليات التنكسية المرضية في الجهاز العصبي. وتشمل مزايا الطاير كنظام تجريبي معرفة منشأ الجينية، فترة حياة قصيرة وإمكانية لمراقبة وتحليل كمي السلوكيات المعقدة. التعبير عن جينات مرض مرتبط في السكان العصبية محددة من الدماغ ذبابة الفاكهة، ويمكن استخدامها في تصميم نموذج لأمراض الاعصاب الإنسان مثل الشلل الرعاش والزهايمر ^5.

الدوبامين (DA) الخلايا العصبية هي من بين السكان العصبية الأكثر ضعفا في الدماغ البشري الشيخوخة. في مرض باركنسون (PD)، واضطراب حركة الاعصاب الأكثر شيوعا، وتسارع فقدان الخلايا العصبية DA يؤدي إلى الانخفاض التدريجي الذي لا رجعة فيه في وظيفة الحركي. بالإضافة إلى العمر والتعرض للسموم البيئية، ويتفاقم فقدان الخلايا العصبية DA بواسطة الطفرات محددة في الترميزأو مناطق المروج من عدة جينات. تحديد هذه الأليلات PD المرتبطة يوفر أساس تجريبي لاستخدام ذبابة الفاكهة كنموذج لدراسة تنكس عصبي من الخلايا العصبية DA في الجسم الحي. على سبيل المثال، التعبير عن الجينات البشرية α-synuclein PD-مرتبط في ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية DA يلخص بعض الملامح من الأمراض التي تصيب البشر، مثل الفقدان التدريجي للخلايا العصبية DA وانخفاض وظيفة الحركي ^2. وفقا لذلك، وقد استخدم هذا النموذج بنجاح لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة في PD ^8.

نحن هنا وصف اثنين من المقايسات التي عادة استخدمت لدراسة تنكس عصبي التي تعتمد على عمر الخلايا العصبية DA في ذبابة الفاكهة: فحص التسلق على أساس جفل الناجم عن استجابة انجذاب بالجاذبية السلبية والتيروزين المناعية هيدروكسيلاز من الدماغ الكبار كله يتصاعد الى رصد عدد من الخلايا العصبية DA في أعمار مختلفة. في كلتا الحالتين، في التعبير المجراة من UAS رransgenes تحديدا في الخلايا العصبية DA يمكن تحقيقه باستخدام هيدروكسيلاز التيروزين (TH) المروج-GAL4 خط سائق ^{3، 10.}

Introduction

خصوصية المقايسات وصفها هنا تعتمد على استخدام خط الطيران GAL4 الذي يستغل متواليات التنظيمية من الجين هيدروكسيلاز التيروزين لتحقيق التعبير معينة في الخلايا العصبية الدوبامين ^3. هيدروكسيلاز التيروزين يحفز الخطوة الأولى ومعدل منظم للفي تركيب الدوبامين. مناعية TH في الكبار يتراكب الدماغ يطير مع أن الدوبامين، مما يجعل TH مرشح جيد لتحديد الخلايا العصبية DA في الجسم الحي (انظر على سبيل المثال ^6). وعلاوة على ذلك، فإن نمط التعبير عن THGal4 هو أكثر تحديدا من ذلك من GAL4 خطوط أخرى مثل DdcGal4، والذي يحتوي على متواليات التنظيمية من الجين كربوكسيل دوبا ويدفع التعبير المعدلة وراثيا ليس فقط في الخلايا العصبية DA، ولكن أيضا في الخلايا العصبية سيروتونيني المفعول ومجموعات فرعية من الخلايا الدبقية ³ .

Feany وبندر (2000): لاحظ أولا أن التعبير عموم العصبية للإنسان الجين α-synuclein PD-مرتبط يسرع الفقدان التدريجي من ستاrtle التي يسببها السلوك انجذاب بالجاذبية السلبية في ذبابة الفاكهة. وقد لاحظنا نتائج مماثلة باستخدام الخلايا العصبية DA-محددة خط THGal4 لدفع expressionof إلى α-synuclein التحوير ¹⁰ وتستخدم هذه ظيفية للقراءة لدراسة دور اعصاب من مسار Nrf2 في هذا ذبابة الفاكهة نموذجا للPD ^14. ويتم تكييف الفحص المحددة الموصوفة هنا من ² و ^3.

ذبابة الفاكهة الدماغ يحتوي على أكثر من 100 الخلايا العصبية DA، وترتيبها في لا يقل عن 5 مجموعات مختلفة (PPL1، PPL2، PAL، PPM1 / 2، PPM3) التي يمكن تصور كليا يتصاعد الدماغ عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر (انظر على سبيل المثال ¹¹ و ^7). انها لا تزال مثيرة للجدل سواء أو ليس عدد الخلايا العصبية DA في الانخفاض الدماغ ذبابة الفاكهة مع تقدم العمر ^{9 و 11،} ولكن لوحظ تنكس عصبي التي تعتمد على العمر في الذباب حيث تم تحور الجينات PD-مرتبط / بإفراط (overexpressed) لنمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان5. التعبير عن الإنسان α-DA synuclein في الخلايا العصبية لديها مثل هذا التأثير، وبالتالي، قد استخدمت كنموذج لPD. هنا نحن تصف مقايسة لالخلايا العصبية DA الاعتماد في الدماغ كله يتصاعد باستخدام TH كعلامة الخلية. وقد تم تكييف هذا الاختبار في الفترة من ¹³ و ^10.

Protocol

1. باغت بفعل سلبي الفحص انجذاب بالجاذبية حدد الذباب من النمط الجيني المطلوب، بفصلها بين الجنسين، وبشكل عشوائي مجموعة منهم في أفواج من 20-30 الحيوانات والوجه لهم في قوارير غذائية جديدة كل 2-3 أيام؛ اختبار كل مجموعة من الذب…

Representative Results

لقد استخدمت المقايسات الموصوفة هنا إلى دراسة دور الإجهاد واقية المسار Nrf2 في نموذج ذبابة الفاكهة من PD 14. يعتمد هذا النموذج على التعبير عن الإنسان الجين α-synuclein في الخلايا العصبية DA باستخدام TH GAL4 السائق 2، 10. ويبين <st…

Discussion

المقايسات الموصوفة هنا توفر نهجا مفيدا لدراسة دور الجينات المحددة، مما يشير إلى مسارات أو مركبات صغيرة في صيانة الخلايا العصبية DA في الشيخوخة، وكذلك في مختلف الخلفيات الوراثية المرتبطة بالمرض (استعرضت في ^5).

وباغت التي يسب?…

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
			Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)

Materials Table.