神経変性表現型を評価する<em>ショウジョウバエ</em>クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色
Summary
ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述する<em>ショウジョウバエ</em>：登山/ DAニューロンの変性と脳全体のマウントのDAニューロンを特定し、カウントするために使用されているチロシン水酸化酵素の免疫の機能的効果を研究することができます驚愕誘発性の負の走地性アッセイ。
Abstract
キイロショウジョウバエは、神経系の老化と病的変性過程を研究するための貴重なモデル生物である。実験系としてのハエの利点はその遺伝扱いやす、短寿命と複雑な行動を観察し、定量的に分析するための可能性を含む。 ショウジョウバエの脳の特定の神経集団における疾患にリンクされた遺伝子の発現は、例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー5、ヒト神経変性疾患をモデル化するために使用することができる。
ドーパミン作動性（DA）ニューロンは、高齢化、人間の脳の中で最も脆弱な神経細胞集団の一つである。パーキンソン病では（PD）、最も一般的な神経変性運動障害は、DAニューロンの加速された損失は運動機能が徐々にかつ不可逆的な衰退につながる。年齢および環境毒素への曝露に加えて、DAニューロンの損失を符号化における特定の突然変異によって悪化するいくつかの遺伝子のまたはプロモーター領域。そのようなPD関連対立遺伝子の同定は、in vivoでの DAニューロンの神経変性を研究するためのモデルとしてのショウジョウバエの使用のための実験的な基礎を提供しています。例えば、 ショウジョウバエ DAニューロンの反復するヒトの疾患のいくつかの機能、DAニューロンの例えば進行性消失と減少し運動機能2におけるPD-リンクヒトα-シヌクレイン遺伝子の発現。したがって、このモデルは正常PD 20.32潜在的な治療標的を同定するために使用されている。
ここでは、一般的にショウジョウバエのDAニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために使用されている2つのアッセイを説明：大人になって脳の驚愕誘発される負の走地性応答およびチロシン水酸化酵素の免疫染色に基づいて登山 アッセイは、DAニューロンの数を監視するためにマウント異なる年齢で。どちらの場合も、UAS、tのインビボ発現具体的にはDAのニューロンにおけるransgenesは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター-Gal4のドライバ線3、10を使用することによって達成することができる。
Introduction
ここに記載されるアッセイの特異性は、ドーパミン作動性ニューロン3における特異的発現を達成するために、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の調節配列を利用したGal4フライラインの使用に依存している。チロシンヒドロキシラーゼは、ドーパミン合成の最初と律速段階を触媒する。ドーパミンのそれと成人のハエの脳の重なりでTH免疫反応性は、（実施例6を参照）、in vivoで DAニューロンを同定するために良い候補TH作る。また、THGal4の発現パターンは、ドーパ脱炭酸酵素遺伝子から調節配列が含まれており、DAニューロンだけでなく、トランスジェニック発現を駆動するようDdcGal4など他Gal4のラインのそれよりもより具体的であるだけでなく、3グリア細胞のセロトニン作動性ニューロンのサブセットで。
Feanyとベンダー（2000）最初のPD-リンクヒトα-シヌクレイン遺伝子の汎神経表現は、STAの漸進的損失を加速することが観察さショウジョウバエのRTLE誘発性陰性走地性の動作が。我々はexpressionofα-シヌクレイン導入遺伝子10を駆動するためにDA-ニューロン特異THGal4ラインを使用して同様の結果を観察し、この中でNrf2の経路の神経保護の役割を研究するために、この機能の読み出しに使用されているPD 14のショウジョウバエモデル。ここで説明する特定のアッセイは、2および3から適合される。
ショウジョウバエの脳は、共焦点顕微鏡で脳全体のマウントに可視化することができる、少なくとも5つの異なるクラスタ（PPL1、PPL2、PAL、PPM1 / 2、PPM3）（実施例11と7を参照）に配置された100以上のDAニューロンが含まれています。それは11、9歳とショウジョウバエ脳の下落でDAニューロンの数かどうかはまだ議論の余地があるが、年齢依存性神経変性は、PD-リンクされた遺伝子がヒトの疾患をモデル化するために変異/過剰発現されたハエで観察される5。 DAのニューロンにおけるヒトα-シヌクレインの発現は、そのような効果を有し、したがって、PDのモデルとして用いられている。ここでは、DAニューロンが細胞マーカーとしてTHを使用してマウントし、脳全体でカウントするためのアッセイを記述します。このアッセイは、13と10から適応されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
アッセイは、経路または異なる疾患連動型遺伝的背景（5件）で同様に高齢化でDAニューロンの維持に小さな化合シグナリング、特定の遺伝子の役割を研究するための有用なアプローチを提供し、ここで説明。
ショウジョウバエの驚愕誘発される負の走地性の動作が広く、特にPD連動型変異の存在下で異なる遺伝的背景におけるDAニューロンの機能のための?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は有用な議論のための技術支援とGerasimos P. Sykiotisためクリスティンソマーズ、フライ銘柄に対してレオPallanckに感謝します。この作品は、MCBにNIH訓練助成T32CA009363によって賄われていた
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) |
Materials Table.
References
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