In vivo beeldvorming van tumorale angiogenese met behulp van fluorescentie confocale videomicroscopie
Summary
In dit artikel presenteren we een methode om tumor bloedvaten analyseren in vivo met behulp van dynamische contrast-verbeterde fluorescentie videomicroscopie. Twee kwantitatieve parameters werden overgenomen: functionele capillaire dichtheid als gevolg van de doorbloeding van de tumor, en de index lekkage als gevolg van de lekkage van de endotheliale wand.
Abstract
Fibered confocale fluorescentie in vivo beeldvorming met een optische vezelbundel gebruikt hetzelfde principe als fluorescerende confocale microscopie. Het kan fluorescente wekken in situ elementen via optische vezels en noteer aantal geëmitteerde fotonen, via dezelfde optische vezels. De lichtbron is een laser die de spannende licht stuurt door middel van een element binnen de vezel bundel en als het scant over het monster, herschept een afbeelding pixel voor pixel. Aangezien deze scan is zeer snel, door het te combineren met speciale software voor beeldverwerking, kunnen de beelden in real-time met een frequentie van 12 beelden / sec worden verkregen.
We ontwikkelden een techniek om kwantitatief karakteriseren capillaire morfologie en functie, met behulp van een confocale fluorescentie videomicroscopie apparaat. De eerste stap in ons experiment was 5 seconden films op te nemen in de vier kwadranten van de tumor om het capillaire netwerk visualiseren. Alle films werden verwerkt met behulp van software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Parijs Frankrijk) dat een geautomatiseerde segmentatie van schepen rond een gekozen diameter (10 micrometer in ons geval) uitvoert. Zo kunnen we de functionele capillaire dichtheid ", die de verhouding tussen het totale schip stippellijn de totale oppervlakte van het beeld kwantificeren. Deze parameter is een surrogaat marker voor microvasculaire dichtheid, meestal gemeten met behulp van pathologie gereedschap.
De tweede stap was om films van de tumor opnemen over 20 min om lekkage van de macromoleculaire contrastmiddel te kwantificeren door de capillaire wand in het interstitium. Door het meten van de verhouding van de signaalintensiteit in het interstitium boven in de vaten, een "index lekkage werd verkregen, als een surrogaat marker voor capillaire permeabiliteit.
Introduction
Angiogenese is een complex proces 1 dat de vorming van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande schepen gaat. Pathologische veranderingen in weefsel microcirculatie, samengesteld arteriolen, capillairen, venulen en zijn betrokken bij een groot aantal ziekten zoals kanker, ontsteking, of diabetes. Het is daarom essentieel om methoden om microvessel structuur en functie kwantitatief beoordelen. Imaging maakt de studie van microvaatjes in een niet-of micro-invasieve wijze in real-time en in vivo, en herhaalde metingen in de tijd in hetzelfde dier 2.
Momenteel wordt de dynamische contrast-versterkte (DCE) beeldvorming 3 vaak gebruikt om weefsel microcirculatie te beoordelen. Dynamisch contrast-versterkte beeldvorming is een techniek die volgt na verloop van tijd de biologische verdeling van een tracer intraveneus geïnjecteerd. Van deze overname, kan kwantitatieve parameters worden gehaald als gevolg van weefsel vascularisatie. DCE beeldvormingis meestal gebruikt met CT, MRI en echografie. Echter, deze technieken geen direct bekijken van de microvaatjes, aangezien hun resolutie, anders dan bij het gebruik van specifieke experimentele apparatuur blijft meestal macroscopische.
In dit artikel stellen we voor om de tumorvaatstelsel studeren aan de microscopische schaal en in vivo met behulp van dynamische contrast-versterkte optische beeldvorming, met fibered confocale videomicroscopie. We gebruikten een macromoleculaire contrastmiddel (FITC-dextran) die uitsluitend in vaten of lekkage blijft door de endotheliale barrière in het interstitium, volgens het molecuulgewicht en de eigenschappen van het endotheel van het onderzochte weefsel 4. Hierdoor kon de studie van beide microvessel structuur, door de juiste afbakening van schepen, en capillaire permeabiliteit, door lekken en zich ophopen in het interstitium.
Protocol
Representative Results
Discussion
De studie van de tumor microcirculatie is essentieel in het begrijpen van de pathofysiologie van tumorgroei, de verspreiding en de respons op de therapie 1 geworden. Optische beeldvorming is een van de technieken die kunnen worden gebruikt om de capillairen observeren met een fluorescerend contrastmiddel en morfologische (functionele capillaire dichtheid) en functionele (index lekkage) kwantificeert.
De fluorescentie microscopie we in deze studie heeft zowel voordelen en beperking…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio – MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. . Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
