Een methode wordt gepresenteerd voor de reconstructie van model nucleosomale arrays van recombinante kernhistonen en tandem herhaalde nucleosoom positionering DNA. We beschrijven ook hoe sedimentatiesnelheid experimenten analytische ultracentrifuge en atomic force microscopie (AFM) worden gebruikt voor het monitoren van de mate van nucleosomale matrix verzadiging na reconstitutie.
Kern histon octameren die herhaaldelijk zijn verdeeld langs een DNA-molecuul worden genoemd nucleosomale arrays. Nucleosomale arrays worden verkregen op twee manieren: zuivering uit in vivo bronnen of reconstitutie in vitro van recombinante kernhistonen en tandem herhaalde positionering nucleosoom DNA. Deze methode heeft het voordeel dat voor de montage van een qua samenstelling uniform en nauwkeurig gepositioneerd nucleosomale array. Sedimentatiesnelheid experimenten in de analytische ultracentrifuge opbrengst informaties grootte en vorm van macromoleculen door analyse van de snelheid waarmee ze migreren door oplossing onder centrifugale kracht. Deze techniek, samen met atomic force microscopie kan worden gebruikt voor kwaliteitscontrole, zodat de meerderheid van DNA-matrijzen verzadigd met nucleosomen na reconstitutie. Hier beschrijven we de protocollen noodzakelijk milligram hoeveelheden lengte reconstitueren en compositioneel defined nucleosomale arrays geschikt voor biochemische en biofysische studies van chromatine structuur en functie.
Eukaryote genomen niet bestaan als naakt DNA, maar eerder worden samengeperst en georganiseerd door gebonden eiwitten. Deze complexen van DNA en eiwitten bekend als chromatine. De basis repeterende eenheid van chromatine is de nucleosoom. Een nucleosoom bestaat uit histon octameer en 146 basenparen van het DNA rond de histon octameer ongeveer 1,6 keer 1. De histon octameer bestaat uit twee exemplaren elke kern histonen H2A, H2B, H3 en H4. Kern histon octameren die herhaaldelijk zijn verdeeld langs een DNA-molecuul worden genoemd nucleosomale arrays. De uitgebreide structuur van nucleosomale arrays is aangeduid als 10 nm vezel of "kralen aan een snoer" structuur aanwezig in vitro onder lage zoutconcentraties 2. De 10 nm vezel is in staat om condensatie in hogere orde structuren door intra-reeks verdichting en / of inter-array-oligomerizatie 2. Deze hogere orde structuren kunnen worden geïnduceerd in aanwezigheid van zouten,of kan worden beïnvloed door de binding van chromatine architectonische eiwitten aan de nucleosomale matrix 3,4. Niveaus van chromatine verdichting worden omgekeerd gecorreleerd met de snelheid van transcriptie in vivo 5,6. Recent onderzoek wijst op het belang van de structurele organisatie van genomen in processen zoals differentiatie, de ontwikkeling van kanker, en anderen 7,8. Het gebruik van nucleosomale arrays chromatinestructuur en functie te bestuderen is wijdverspreid. Hier beschrijven we een werkwijze voor de assemblage van nucleosomale arrays van recombinante kernhistonen en nucleosoom positionering DNA.
Met behulp van recombinant DNA met tandem herhalingen van nucleosoom positionering sequenties maakt de reconstitutie van arrays die regelmatige afstand nucleosomen bevatten. Twee van de meer populaire positionering sequenties 5S rRNA gensequentie en de "601"-sequentie 9,10. De 601 serie werd afgeleid van SELEX experimenten en more sterker positioneert nucleosomen dan de 5S-sequentie 11. Bijgevolg linker DNA lengte van de arrays 601 is homogener. Tandem herhaalde DNA nucleosoom positionering wordt verkregen door gelfiltratie 4,12. Recombinant histonen gezuiverd uit E. coli onder denaturerende omstandigheden 13. Het gebruik van recombinante histonen kan men de histon samenstelling van de nucleosomale arrays zorgvuldig controleren. Bijvoorbeeld, kernhistonen dragende specifieke mutaties 14 of post-translationele modificaties 15,16 kan worden vervangen voor wild type kernhistonen.
Sedimentatiesnelheid experimenten toezien op de snelheid van sedimentatie van macromoleculen in oplossing onder een toegepaste middelpuntvliedende kracht 17. Deze geeft informatie over de grootte en de vorm van macromoleculen in een monster. Sedimentatiesnelheid experimenten zijn dus een geschikt instrument voor het bestuderen oplossing staat veranderingen in chromatine vezelstructuur als gevolg van chromatinecondensatie 18. Belangrijker is, is het eerst nodig om sedimentatiesnelheid experimenten gebruiken als een kwaliteitscontrole stap in nucleosomale reeks reconstitutie. Als DNA en nucleosomen niet worden gecombineerd bij de juiste molaire verhouding, kan de arrays onder-of oververzadigd met kernhistonen. Aldus wordt de informatie uit sedimentatiesnelheid experimenten om te verzekeren dat de juiste DNA verzadigd met nucleosomen. Het is belangrijk om alternatieve methoden voor het schatten van de verzadiging van DNA met nucleosomen, vooral als die met een eerder niet gekenmerkte DNA template. Daarom hebben we ook een werkwijze beschreven voor het analyseren van nucleosomale arrays met behulp van atomic force microscopie (AFM). AFM is een techniek die het mogelijk maakt visualisatie van de effecten van een aantal parameters, zoals de mate van verzadiging, effect van de aanwezigheid van histon varianten of de effecten van MgCl2 19,20. AFM heeft ook toepassing geweested aan nucleosomen bestuderen met behulp van time lapse imaging 21. In vitro gemonteerd nucleosomale 12-meer arrays zijn bijzonder vatbaar voor AFM onderzoeken omdat zij behoren in de juiste maat bereik voor AFM beeldvorming 22. In de huidige studie hebben we gebruik gemaakt van de AFM nucleosomale arrays als kwaliteitscontrole, evenals een middel van het bevestigen van de gegevens van AUC ("zien is geloven"). Naast eenvoudige visualisatie, AFM kan gemeten hoogteprofielen monsters als extra metrisch.
Model nucleosomale arrays zijn een zeer nuttig instrument voor de in vitro studie van chromatine structuur en functie. Zo zijn ze veel gebruikt om het mechanisme van chromatine condensatie vezels bestuderen oplossing 30-34, en maakte het mogelijk een röntgenstraal structuur van een tetranucleosome 35 verkrijgen. Meer recent hebben ze nuttig zijn in het ontcijferen van de structurele effecten van specifieke kern histon-varianten, mutanten en posttranslationele modificaties 14-16,36</s…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie GM45916 en GM66834 om JCH en een beurs van de International Rett Syndroom Stichting AK Dit werk werd ondersteund door NIH verlenen GM088409 en Howard Hughes Medical Institute bijdragen aan KL
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |