Представлен метод для восстановления модельных нуклеосомных массивов из рекомбинантных стержневых гистонов и тандемно повторного ДНК нуклеосом позиционирования. Мы также описать, как эксперименты скорости оседания в аналитической ультрацентрифуге и атомно-силовой микроскопии (АСМ) используются для мониторинга масштабов нуклеосомной насыщения массива после восстановления.
Основные гистонов октамеры, которые повторно расположенных вдоль молекулы ДНК называют нуклеосомной массивы. Нуклеосомной массивы, полученные в одном из двух способов: очищение от естественных условиях источников в, или восстановление в пробирке из рекомбинантных стержневых гистонов и тандемно повторил ДНК нуклеосом позиционирования. Последний метод имеет то преимущество, что позволяет для сборки более композиционно форме и точно позиционируется нуклеосомной массива. Эксперименты скорости седиментации в аналитической информации текучести ультрацентрифуге о размере и форме макромолекул путем анализа скорости, с которой они мигрируют через раствора под действием центробежной силы. Этот метод, а также атомно-силовой микроскопии, могут быть использованы для контроля качества, гарантируя, что большинство ДНК-матриц насыщены нуклеосом после восстановления. Здесь мы опишем протоколы, необходимые для восстановления миллиграмм количества длину и композиционно Defined нуклеосомной массивы, пригодные для биохимических и биофизических исследований структуры хроматина и функции.
Геномах эукариот не существуют как чистую ДНК, а уплотняются и организован связанных белков. Эти комплексы ДНК и белка известны как хроматина. Основная повторяющееся звено хроматина является нуклеосома. Нуклеосом состоит из гистона октамера и 146 пар оснований ДНК, обернутой вокруг гистона октамер примерно в 1,6 раза 1. Гистон октамер состоит из двух копий каждого из стержневых гистонов H2A, H2B, H3 и H4,. Основные гистонов октамеры, которые повторно расположенных вдоль молекулы ДНК называют нуклеосомной массивы. Расширенная структура нуклеосомных массивов был передан в качестве 10 нм волокна или "бусины на нитке" структуры и присутствует в пробирке в условиях низких соли 2. 10 нм волокна способен конденсации в высших порядков структур через внутри массива уплотнения и / или между массива олигомеризации 2. Эти структуры более высокого порядка может быть индуцирован в присутствии солей,или может быть под влиянием через связывание хроматина архитектурных белков в нуклеосомной массива 3,4. Уровни хроматина уплотнения являются обратно коррелирует со скоростью транскрипции в естественных условиях 5,6. Недавние исследования подчеркивает важность структурной организации геномов в таких процессах, как дифференциации, развитию рака и других 7,8. Использование нуклеосомных массивов изучать структуру хроматина и функции стала широко распространенной. Здесь мы опишем метод для сборки нуклеосомных массивов из рекомбинантных стержневых гистонов и ДНК нуклеосом позиционирования.
Использование рекомбинантной ДНК с тандемных повторов нуклеосомных последовательностей позиционирования позволяет восстановления массивов, которые содержат регулярно расположенных нуклеосом. Два из наиболее популярных последовательностей позиционирования являются последовательность гена 5S рРНК и "601" последовательность 9,10. Последовательность 601 была получена из SELEX экспериментов и море сильно позиционирует нуклеосом, чем последовательности 5S 11. Следовательно, длина линкера ДНК из 601 массивов является более однородным. Тандемно повтор ющиес нуклеосом ДНК позиционирование полученный с помощью гель-фильтрации 4,12. Рекомбинантные гистоны очищенный от E. палочка в условиях денатурирующих 13. Использование рекомбинантных гистонов позволяет тщательно контролировать гистонов состав нуклеосомных массивов. Например, стержневых гистонов принимая специфические мутации 14 или пост-трансляционные модификации 15,16 может быть заменен на дикого типа стержневых гистонов.
Эксперименты скорости оседания контролировать скорость осаждения макромолекул в растворе при приложенном центробежной силы 17. Это дает информацию о размере и форме макромолекул в образце. Таким образом, эксперименты скорости оседания являются подходящим инструментом для изучения изменения состояния решения в хроматина волокнаСтруктура из-за конденсации хроматина 18. Важно отметить, что в первую очередь необходимо использовать эксперименты седиментации скорости как шаг контроля качества в нуклеосомной восстановления массива. Если ДНК и нуклеосомы не объединяются в надлежащее молярном соотношении, массивы могут быть недо-или перенасыщен стержневых гистонов. Таким образом, информация, полученная из экспериментов седиментации скорости используется для того, чтобы должным образом ДНК нуклеосомы насыщен. Важно использовать альтернативные методы оценки насыщенности ДНК с нуклеосом, особенно при работе с ранее неохарактеризованной ДНК-матрицы. Таким образом, мы также описывают способ анализа нуклеосомных массивах, используя атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ является мощная техника, которая позволяет визуализация эффектов ряда параметров, таких как уровень насыщенности, эффекта присутствия вариантов гистонов или последствий MgCl 2 19,20. АСМ также был Appliред изучать динамику нуклеосом используя промежуток времени визуализации 21. Экстракорпоральное собраны нуклеосомной массивы 12-мерные особенно поддаются АСМ исследований, потому что они принадлежат в правильном диапазоне размеров для АСМ-изображений 22. В настоящем исследовании мы использовали АСМ из нуклеосомных массивов как контроль качества, а также средства утверждения данные из AUC ("увижу, не поверю»). В дополнение к простой визуализации, АСМ позволяет измерять профилей высоты образцов в качестве дополнительного показателя.
Модель массивы нуклеосомной являются очень полезным инструментом для изучения в пробирке структуры хроматина и функции. Например, они широко используются для изучения механизма образования конденсата хроматина волокна в растворе 30-34, и позволило получить структуру рентге…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH гранты GM45916 и GM66834 к JCH и общения с Международной Ретта синдром Фонда AK Эта работа также была поддержана NIH грант GM088409 и Медицинского института Говарда Хьюза вклад в KL
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |