संयोजक कोर Histones से nucleosomal सारणियों और nucleosome पोजिशनिंग डीएनए की सभा
Summary
एक विधि पुनः संयोजक कोर histones से मॉडल nucleosomal सरणियों के पुनर्गठन और tandemly दोहराया nucleosome स्थिति डीएनए के लिए प्रस्तुत किया है. हम भी विश्लेषणात्मक ultracentrifuge में अवसादन वेग प्रयोगों, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) पुनर्गठन के बाद nucleosomal सरणी संतृप्ति की हद तक नजर रखने के लिए उपयोग किया जाता है वर्णन कैसे.
Abstract
Repetitively एक डीएनए अणु के साथ स्थान दिया गया है कि कोर histone octamers nucleosomal सरणियों कहा जाता है. Nucleosomal सरणियों दो तरीकों में से एक में प्राप्त कर रहे हैं: में विवो स्रोतों से शुद्धि, या पुनः संयोजक कोर histones से इन विट्रो में पुनर्गठन और tandemly दोहराया nucleosome स्थिति डीएनए. बाद विधि एक अधिक compositionally वर्दी के विधानसभा और ठीक से तैनात nucleosomal सरणी के लिए अनुमति का लाभ दिया है. वे केन्द्रापसारक बल के तहत समाधान के माध्यम से विस्थापित दर जिस पर विश्लेषण करके बड़े अणुओं के आकार के आकार के बारे में विश्लेषणात्मक ultracentrifuge उपज जानकारी में अवसादन वेग प्रयोगों. इस तकनीक, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ, डीएनए टेम्पलेट्स के बहुमत के पुनर्गठन के बाद nucleosomes साथ संतृप्त कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने, गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ हम लंबाई की मिलीग्राम मात्रा में पुनर्गठित करने के लिए आवश्यक है और compositionally डी प्रोटोकॉल का वर्णनchromatin संरचना और समारोह के जैव रासायनिक और biophysical अध्ययन के लिए उपयुक्त efined nucleosomal सरणियों.
Introduction
यूकेरियोटिक जीनोम के रूप में नग्न डीएनए मौजूद नहीं है, बल्कि ठोस और बाध्य प्रोटीन द्वारा आयोजित कर रहे हैं. डीएनए और प्रोटीन की इन परिसरों chromatin के रूप में जाना जाता है. chromatin की बुनियादी दोहराई इकाई nucleosome है. एक nucleosome histone octamer और के बारे में 1.6 गुना 1 octamer histone चारों ओर लिपटा डीएनए के 146 आधार जोड़े के होते हैं. histone octamer दो प्रतियां कोर histones H2A, H2B, H3, और H4 में से प्रत्येक से बना है. Repetitively एक डीएनए अणु के साथ स्थान दिया गया है कि कोर histone octamers nucleosomal सरणियों कहा जाता है. nucleosomal सरणियों की विस्तारित संरचना संरचना "एक तार पर मोती" 10 एनएम फाइबर या के रूप में जाना जाता है और कम नमक स्थितियां 2 के तहत इन विट्रो में उपस्थित किया गया है. 10 एनएम फाइबर इंट्रा सरणी संघनन और / या अंतर – सरणी oligomerization 2 के माध्यम से उच्च आदेश संरचनाओं में संघनित करने में सक्षम है. ये उच्च आदेश संरचनाओं, लवण की उपस्थिति में प्रेरित किया जा सकता हैया nucleosomal सरणी 3,4 करने chromatin वास्तु प्रोटीन की बाइंडिंग के माध्यम से प्रभावित किया जा सकता है. Chromatin संघनन के स्तर inversely विवो 5,6 में प्रतिलेखन की दर के साथ सहसंबद्ध होते हैं. हाल के शोध से इस तरह के भेदभाव, कैंसर के विकास, और दूसरों 7,8 प्रक्रियाओं के रूप में जीनोम की संरचनात्मक संगठन के महत्व पर प्रकाश डाला गया. chromatin संरचना और समारोह का अध्ययन करने के nucleosomal सरणियों का उपयोग व्यापक हो गया है. यहाँ हम पुनः संयोजक कोर histones और nucleosome स्थिति डीएनए से nucleosomal सरणियों की विधानसभा के लिए एक विधि का वर्णन.
Nucleosome स्थिति दृश्यों के मिलकर दोहराता साथ पुनः संयोजक डीएनए का प्रयोग नियमित रूप से स्थान nucleosomes होते हैं कि सरणियों के पुनर्गठन के लिए अनुमति देता है. अधिक लोकप्रिय पोजीशनिंग दृश्यों के दो 5S rRNA जीन अनुक्रम और "601" अनुक्रम 9,10 हैं. 601 अनुक्रम SELEX प्रयोगों और mor से निकाला गया थाई दृढ़ता से 5 एस अनुक्रम 11 से nucleosomes पदों. नतीजतन, 601 सरणियों की लिंकर डीएनए लंबाई अधिक सजातीय है. Tandemly दोहराया nucleosome स्थिति डीएनए जेल निस्पंदन 4,12 द्वारा प्राप्त की है. संयोजक histones ई. से शुद्ध कर रहे हैं denaturing स्थितियों 13 के तहत कोलाई. पुनः संयोजक histones के उपयोग के एक ध्यान से nucleosomal सरणियों की histone रचना नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, कोर 15,16 जंगली प्रकार कोर histones के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है विशिष्ट परिवर्तन 14 या बाद translational संशोधनों असर histones.
अवसादन वेग प्रयोगों में एक आवेदन केन्द्रापसारक बल 17 के तहत समाधान में अणुओं की अवसादन की दर पर नजर रखने के. यह एक नमूना में बड़े अणुओं के आकार के आकार के बारे में जानकारी देता है. अवसादन वेग प्रयोगों इस प्रकार chromatin फाइबर में समाधान राज्य में परिवर्तन के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त उपकरण हैंchromatin संक्षेपण 18 के कारण संरचना. महत्वपूर्ण बात है, यह nucleosomal सरणी पुनर्गठन में एक गुणवत्ता नियंत्रण कदम के रूप में अवसादन वेग प्रयोग का उपयोग करने के लिए पहली आवश्यक है. डीएनए और nucleosomes उचित दाढ़ अनुपात में संयुक्त नहीं कर रहे हैं, सरणियों के तहत या अधिक संतृप्त कोर histones के साथ हो सकता है. इस प्रकार, अवसादन वेग प्रयोगों से प्राप्त जानकारी के डीएनए ठीक से nucleosomes के साथ संतृप्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह एक पहले से uncharacterized डीएनए टेम्पलेट के साथ काम कर रहा है, खासकर अगर nucleosomes के साथ डीएनए की संतृप्ति अनुमान लगाने के लिए वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, हम भी परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) का उपयोग nucleosomal सरणियों के विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन. AFM अनुमति देता है एक शक्तिशाली तकनीक है ऐसे संतृप्ति का स्तर, histone वेरिएंट की उपस्थिति का प्रभाव या 2 MgCl 19,20 के प्रभाव के रूप में मानकों की एक संख्या के प्रभाव के दृश्य. AFM भी appli किया गया हैएड समय चूक इमेजिंग 21 का उपयोग nucleosome गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए. इन विट्रो वे AFM इमेजिंग 22 के लिए सही आकार रेंज में हैं क्योंकि nucleosomal 12 पूर्व सरणियों AFM पढ़ाई के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी हैं इकट्ठे हुए. वर्तमान अध्ययन में हम एक गुणवत्ता नियंत्रण के साथ ही ("देखना ही विश्वास करना है") नीलामी से डेटा की पुष्टि करने का एक साधन के रूप में nucleosomal सरणियों के AFM का इस्तेमाल किया है. साधारण दृश्य के अलावा, AFM एक अतिरिक्त मीट्रिक के रूप में नमूनों की ऊंचाई प्रोफाइल के माप की अनुमति देता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
मॉडल nucleosomal सरणियों chromatin संरचना और समारोह की इन विट्रो अध्ययन के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण हैं. उदाहरण के लिए, वे व्यापक रूप से हल 30-34 में chromatin फाइबर संघनन की व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किय…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच अनुदान GM45916 और GM66834 JCH करने और इस काम ए.के. को अंतर्राष्ट्रीय Rett सिंड्रोम फाउंडेशन से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था भी एनआईएच GM088409 और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के.एल. योगदान करने के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
| 6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
| HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
| Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
| 12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
| Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
| XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
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