Montering av nucleosomal arrayer från rekombinanta Kärn Histoner och nukleosom Positionering DNA

Summary

En metod presenteras för beredning av modell nukleosomala arrayer från rekombinanta kärnhistonerna och tandem upprepade nukleosomen positionering DNA. Vi beskriver också hur sedimenteringshastighet experiment i analytisk ultracentrifug och atomkraftsmikroskop (AFM) används för att övervaka omfattningen av nucleosomal array mättnad efter beredning.

Abstract

Kärn histon oktamerer som upprepade gånger är placerade längs en DNA-molekyl som kallas nukleosomala matriser. Nucleosomal matriser erhålles på ett av två sätt: rening från in vivo-källor, eller rekonstitution in vitro från rekombinanta kärnhistonerna och i tandem upprepade nukleosomen positionering DNA. Den sistnämnda metoden har fördelen att möjliggöra montering av en mer sammansättningsmässigt likformig och exakt positionerad nucleosomal array. Sedimentation velocity experiment i analytisk ultracentrifug utbyte information om storleken och formen av makromolekyler genom att analysera den takt med vilken de migrerar genom lösningen under centrifugalkraft. Denna teknik, tillsammans med atomkraftsmikroskopi, kan användas för kvalitetskontroll, vilket garanterar att de flesta DNA-mallar är mättade med nukleosomer efter beredning. Här beskriver vi de protokoll som är nödvändiga för att rekonstituera milligramkvantiteter längd och sammansättnings defined nukleosomala matriser lämpliga för biokemiska och biofysikaliska studier av kromatin struktur och funktion.

Introduction

Eukaryota genom existerar inte som naket DNA, utan snarare kompakteras och organiseras av bundna proteiner. Dessa komplex av DNA och protein är kända som kromatin. Den grundläggande repeterande enhet av kromatin är nukleosomen. En nukleosomen består av histon oktamer och 146 baspar av DNA lindas kring histon oktamer ca 1,6 gånger ^1. Den histon oktamer består av två exemplar vardera av kärn histoner H2A, H2B, H3 och H4. Kärn histon oktamerer som upprepade gånger är placerade längs en DNA-molekyl som kallas nukleosomala matriser. Den utökade struktur nukleosomala matriser har kallat 10 nm fiber eller "pärlor på ett snöre" struktur och finns in vitro under låga saltförhållanden ^2. Den 10 nm fiber kan kondensera till högre ordningens strukturer genom intra-array packning och / eller inter array oligomerisering ^2. Dessa högre ordningens strukturer kan induceras i närvaro av salter,eller kan påverkas genom bindning av kromatin arkitektoniska proteiner till nucleosomal array ^3,4. Nivåer av kromatin kompakte är omvänt korrelerad med graden av transkription in vivo ^5,6. Ny forskning belyser vikten av organisationsstruktur genomen i processer såsom differentiering, cancerutveckling, och övriga ^7,8. Användningen av nukleosomala matriser för att studera kromatin struktur och funktion har blivit utbredd. Här beskriver vi en metod för montering av nukleosomala matriser från rekombinanta kärnhistonerna och nukleosomen positionering DNA.

Användning av rekombinant DNA med tandemupprepningar av nukleosomen positioneringssekvenser möjliggör beredning av matriser som innehåller regelbundet åtskilda nucleosomes. Två av de mer populära positioneringssekvenser är 5S rRNA-gensekvens och "601"-sekvens ^9,10. Den 601-sekvensen härleddes från SELEX experiment och more starkt positionerar nucleosomes än 5S sekvensen ^11. Följaktligen är den linker-DNA längd av 601 arrayer mer homogen. Tandem upprepade nukleosomen positionering DNA erhålls genom gelfiltrering ^4,12. Rekombinanta histoner renas från E. coli under denaturerande betingelser ^13. Användningen av rekombinanta histoner tillåter en att noggrant styra histon sammansättning nukleosomala matriser. Till exempel, histoner kärna bär specifika mutationer ¹⁴ eller posttranslationella modifieringar ^15,16 kan ersätta vildtyp kärnhistonerna.

Sedimente hastighet experiment övervaka graden av sedimentering av makromolekyler i lösning under en tillämpad centrifugalkraft ^17. Detta ger information om storleken och formen av makromolekyler i ett prov. Sedimente hastighet experiment är därför ett lämpligt verktyg för att studera lösning tillstånd ändras i kromatin fiberstruktur på grund av kromatinkondensation ^18. Viktigt är det först nödvändigt att använda sedimentehastighetsexperiment som en kvalitetskontroll steg i nucleosomal array beredning. Om DNA och nucleosomes inte kombineras på rätt molförhållandet kan arrayer vara under-eller övermättad med kärn histoner. Således är den information de fått från sedimenteringshastighet experiment används för att säkerställa att DNA är ordentligt mättad med nukleosomer. Det är viktigt att använda alternativa metoder för att uppskatta mättnad av DNA med nukleosomer, speciellt om du arbetar med en tidigare uncharacterized DNA-mall. Därför beskriver vi också en metod för analys av nukleosomala arrayer med hjälp av atomkraftsmikroskopi (AFM). AFM är en kraftfull teknik som tillåter visualisering av effekterna av ett antal parametrar, såsom graden av mättnad, effekten av närvaron av histon varianter eller effekterna av MgCl ₂ ^19,20. AFM har också varit tillämped för att studera nukleosomen dynamik med intervall avbildning ^21. In vitro monterade nukleosomala 12-mer-arrayer är särskilt mottagliga för AFM studier därför att de hör hemma i rätt storleksordning för AFM avbildning ^22. I den aktuella studien har vi använt AFM av nukleosomala matriser som en kvalitetskontroll och som ett sätt att bekräfta data från AUC ("se är att tro"). Förutom enkel visualisering, gör AFM mätning av höjdprofiler av prov som ett extra mått.

Protocol

1. Montering av rekombinanta kärnhistonerna till oktamerer Bakgrund: Det första steget i nukleosomal array rekonstituering är att framställa nativa kärn histon oktamerer från lyofiliserade rekombinanta kärnhistonerna. Histonproteiner kombineras i lika stora molära mängder och monteras i histon oktamerer genom dialys proverna av ett denatureringsbuffert i återveckningsbuffert. Rena och lyofilisera rekombinanta kärnhistonerna (H2A, H2B, H3, H4) som beskrivs 13….

Representative Results

För att illustrera det protokoll vi beredda nukleosomala arrayer från rekombinanta Xenopus core histoner och DNA som består av 12 tandem 207 bp upprepningar av 601 positioneringssekvens (601 207 x 12). Vi monteras först nativa oktamerer från lyofiliserade kärnhistonerna och renades sedan de oktamerer genom FPLC med användning av en S200-kolonn (Figur 1A). Större komplexen eluerar tidigare från S200-kolonn. Histoner elueras allmänt i denna ordning: ospecifika histon aggregat…

Discussion

Modell nukleosomala arrayer är ett mycket användbart verktyg för att studera kromatin struktur och funktion in vitro. Exempelvis har de använts i stor utsträckning för att studera mekanismen för kromatin fiber kondensation i lösning ^{från 30 till 34,} och gjort det möjligt att erhålla en röntgenbild strukturen hos en tetranucleosome ^35. På senare tid har de visat sig vara användbara för att dechiffrera de strukturella effekterna av specifika kärn histon varianter, mutanter oc…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge	Beckman-Coulter